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目的:肝纤维化(liver fibroisis)是多种原因引起的慢性肝损伤所致的病理改变,主要表现为细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的过度沉积,是肝硬化的早期可逆阶段。有多项研究证实,肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)的激活在肝纤维化发展过程中起关键作用,是肝内ECM的主要细胞来源。抑制HSC活化、增殖与减少ECM合成是目前阻断、逆转肝纤维化的重要策略。本课题组从山芝麻中分离鉴定出一种三萜化合物,即山芝麻酸甲酯(methyl helicterate,MH),在前期研究的基础上,以TGF-β1/Smads信号通路为切入点,探讨山芝麻酸甲酯对肝星状细胞活化的影响以及其体外抗纤维化作用机制。方法:本研究采用的细胞系包括大鼠肝星状细胞(HSC-T6)、人肝星状细胞(LX2)、人正常肝细胞(7702)。将HSC-T6和LX2细胞分为6组:正常组,TGF-β1刺激组,MH低、中、高剂量组(12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL),阳性对照组(LY364947组)。7702细胞分为4组:正常组,MH低、中、高剂量组(12.5、25、50μg/mL)。为了评价MH的细胞毒效应,本实验采用不同浓度MH作用于肝星状细胞,继而利用MTT法检测MH对肝星状细胞增殖的影响;此外,细胞用TGF-β1预处理30 min后,加入MH继续孵育24 h,试剂盒检测细胞内乳酸脱氢酶(LDH)的释放量;划痕实验观察MH对细胞迁移的影响;AO-EB染色、流式细胞术分别检测细胞凋亡及细胞周期;免疫组化法测定转化生长因子受体Ⅰ(TβRI)、Ⅰ型胶原蛋白(col-i)、Ⅲ型胶原蛋白的表达(col-iii)的表达;rt-qpcr法检测tβri、tβrii、smad2、smad3、smad7和纤溶酶原激活物抑制因子(pai-1)mrna的表达;westernblot法检测α-sma、col-i、col-iii、tβri、tβrii和smad2/3的蛋白表达水平。结果:(1)mh对细胞增殖和ldh释放量的影响实验发现,mh在6.25~200μg/ml时,对hsc-t6、lx2和7702细胞的增殖具有明显抑制作用(p<0.05或p<0.01),且呈浓度依赖性;与此相反,TGF-β1刺激后可明显促进细胞增殖(p<0.05或p<0.01)。另外,mh对TGF-β1诱导的肝星状细胞增殖亦具有明显的抑制作用(p<0.05或p<0.01)。此外,ldh检测实验表明TGF-β1刺激组细胞ldh释放量无明显改变,当mh浓度>12.5μg/ml时,作用24h后,hsc-t6细胞ldh释放量明显增加(p<0.05)。以上结果说明mh对肝星状细胞有一定的细胞毒性作用。(2)mh对细胞迁移、凋亡及细胞周期的影响实验发现,与正常组比较,TGF-β1刺激组细胞迁移明显加快,细胞形态学、细胞凋亡及周期则无明显变化。mh(12.5、25和50μg/ml)作用24h后,细胞迁移受到抑制,迁移速度减慢;凋亡实验表明,mh可引起细胞凋亡增多,且呈药物浓度依赖性(p<0.05或p<0.01)。流式细胞术检测证实,mh诱导细胞周期阻滞于g2期。这些结果提示,mh可能是通过抑制肝星状细胞的活化、促进其凋亡,而起到抗肝纤维化的作用。(3)mh对α-sma和胶原的影响免疫组化检测结果发现,与正常组比较,TGF-β1刺激组col-i、col-iii的表达显著上调(p<0.01),给予mh干预后,col-i、col-iii的表达被明显抑制(p<0.01);类似的,westernblot检测结果表明TGF-β1可提高α-sma、col-i、col-Ⅲ的表达,而mh能下调α-sma、col-i、col-iii的表达(p<0.05或P<0.01)。提示,MH能抑制胶原的生成,减少ECM的过度沉积,这可能是其发挥抗肝纤维化作用的药理学基础。(4)MH对TGF-β1/Smads信号通路的影响实时荧光定量PCR检测结果发现,与正常组比较,TGF-β1刺激组TβRI、TβRII、Smad2、Smad3和PAI-1 mRNA的表达显著提高(P<0.05或P<0.01),而MH治疗组与LY364947阳性对照组的这些组基因mRNA的表达明显下降(P<0.05或P<0.01)。另外,Western blot检测发现,TGF-β1刺激组TβRI、TβRII、Smad2/3蛋白的表达量显著增加(P<0.05或P<0.01);给予MH或LY364947干预后能明显逆转这些蛋白的异常表达。提示,MH抑制肝星状细胞活化的作用可能与阻断TGF-β1/Smads信号通路有关。结论:MH能明显抑制肝星状细胞的增殖、促进其凋亡、减少胶原的生成和过度沉积,其机制可能与抑制TGF-β1/Smads信号通路有关。