论文部分内容阅读
目的:建立幼龄鼠1型糖尿病(type 1 diabetes,T1D)模型,探讨鼠骨实质来源间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)治疗T1D的疗效,为MSCs治疗儿童糖尿病提供理论与实验依据。方法:1.幼龄鼠T1D模型的建立。取3周龄C57BL/6小鼠,给予连续小剂量腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)5d,剂量分别为30、50、70、90mg/kg。比较不同剂量模型小鼠的一般生存状态、血糖变化、体质量改变及病理学改变,获得最佳建模剂量。2.分离培养小鼠骨实质来源MSCs。选取1周龄SPF级乳鼠,提取小鼠的长骨消化并培养MSCs;倒置显微镜下观察培养至第3代细胞的细胞形态,流式细胞术检测MSCs的细胞表型;诱导第3代MSCs向成脂肪细胞和成骨细胞分化,并分别采用油红与碱性磷酸酶染色进行相关分化能力的检测,实时荧光定量PCR(fluorescence quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction,q-PCR)检测诱导分化关键转录因子的表达。3.MSCs治疗幼龄鼠T1D模型的疗效观察。分别建立幼龄鼠和成年鼠T1D模型,经尾静脉输注MSCs进行治疗。通过对比随机血糖、HE染色和胰岛素免疫组织化学染色检测胰岛病理学改变情况;HE染色、Masson染色、PASM染色检测肾脏病理学改变;q-PCR检测脾脏淋巴细胞炎性因子的表达,比较MSCs对幼龄鼠和成年鼠T1D的疗效差异。结果:1.采用不同剂量STZ诱导模型建立的结果表明,建模14d后,30 mg/kg和50mg/kg剂量组血糖水平均有升高,分别为7.77±1.24 mmol/L和13.81±2.35mmol/L、但体质量下降不明显(13.02±1.38g;12.69±0.40g);胰岛组织受到轻微损伤,表现为胰岛组织形态缩小,胰岛β细胞减少;胰岛素免疫组化染色浅,成模率低。70mg/kg及90mg/kg剂量组小鼠血糖水平显著升高(17.40±0.92mmol/L;18.07±2.48mmol/L),体质量下降明显(11.33±1.43g;11.57±1.28g);胰岛组织损伤严重,胰岛β细胞仅有少数残存,成模率较高。但建模42d后,90mg/kg剂量组小鼠死亡率高达80%,30mg/kg、50mg/kg、70mg/kg组依次为0%,0%及20%。因此70mg/kg STZ作为诱导低龄鼠T1D的最佳剂量,可得到稳定的动物模型。2.骨片分离法获得的MSCs,细胞形态呈长梭形、旋涡状排布,3代MSCs行流式细胞术检测细胞表型,结果显示,细胞高表达CD29、CD105、Sca-1,不表达CD11b、CD31、CD34、CD45及MHCII。诱导MSCs向成脂肪细胞和成骨细胞分化,油红染色倒置显微镜观察可见红色脂滴,成骨细胞碱性磷酸酶染色阳性。q-PCR检测诱导细胞高表达成脂因子PPAR-γ和成骨因子Runx2,符合MSCs鉴定标准。3.将MSCs经尾静脉分别输注幼龄鼠和成年鼠T1D体内,治疗7d后,幼龄鼠平均血糖水平由18.01±0.84 mmol/L下降至14.42±0.75mmol/L,后期血糖水平平稳;未接受治疗的T1D组,随时间延长血糖水平逐渐缓慢上升,高达20.31±1.33mmol/L。成年T1D组小鼠平均血糖水平显著下降,由23.59±2.39 mmol/L下降至17.83±1.75 mmol/L。胰岛病理学检测结果显示,MSCs治疗组小鼠HE染色胰岛面积及胰岛素免疫组化阳性面积均大于T1D组,且幼龄模型明显优于成年模型。肾脏病理学检测结果表明,T1D组肾小球系膜基质增多,PASM染色基底膜增厚,Masson染色纤维化程度高;而MSCs治疗组的肾脏病理学改变较上述对照组显著减轻。初步探讨MSC作用机制,采用q-PCR检测各组小鼠脾细胞炎症因子表达,结果表明,与T1D组(3.02±0.24,1.75±0.27)相比,MSCs治疗可有效降低脾细胞内IFN-γ与TNF-α的表达(1.27±0.08;1.18±0.16)(p<0.05),上调FoxP3和IL-4的表达(1.00±0.01;1.00±0.06)。结论:成功建立幼龄鼠T1D模型,MSCs可有效治疗幼龄鼠T1D,为儿童糖尿病干细胞治疗提供了可靠的实验依据。