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目的:制作出生2-3d的大乳鼠下切牙牙胚的组织切片,观察FGF10在牙胚颈环区组织的分布。将出生2-3d大乳鼠下切牙牙胚经酶消化后,体视显微镜下分离颈环上皮组织并进行颈环上皮细胞培养,观察颈环上皮细胞的生长特性;进行釉原蛋白免疫细胞化学染色以推测其分化方向;观察用胰酶-EDTA和DispaseⅡ两种不同消化液传代后细胞的存活率和生长状态。本试验旨在分离培养大鼠切牙颈环上皮细胞的基础上,研究颈环上皮细胞的生物学特性和传代培养方法,探讨维持牙源性上皮细胞性状的微环境,为体外连续培养牙源性上皮干细胞并保持其生物学特征以及下一步进行细胞内基因转染提供依据,为牙源性上皮干细胞作为种子细胞进行移植奠定基础。方法:1.实验一:FGF10在大鼠切牙颈环区组织分布的免疫组织化学研究:选择出生2-3d的大乳鼠,断颈处死后,剪取下颌骨,按常规要求制备成石蜡包埋组织块,切片、一抗为FGF10抗体,对照为PBS,免疫组织化学SP法染色后,梯度酒精脱水,二甲苯透明,树脂封片,光学显微镜下观察。2.实验二:大鼠切牙颈环上皮细胞生物学特性研究:①取出生2 d的大乳鼠,引颈处死,置75%酒精浸泡2-3秒钟,超净工作台内无菌条件下用眼科剪刀剪取下颌骨,放入盛有含双抗的Hanks液培养皿中,洗净血液,转入另一盛有含双抗的Hanks液培养皿中,置体视显微镜下,小心用探针分离出下切牙牙胚。经酶消化后,用显微镊从牙胚中机械性撕脱出牙囊和牙乳头,将成釉器用培养液冲洗,置于培养皿中体视显微镜下从成釉器中切取颈环组织,移至培养瓶内置于100%湿度,5%CO2,37℃的培养箱内孵育。待细胞成片生长后差别消化法纯化。②以培养时间为横坐标,不同时间点所得不同的细胞数为纵坐标,绘制在坐标纸上,连接成曲线后即为该细胞的生长曲线。根据公式:DT=t×lg2/（lgNt-lgN0）计算细胞倍增时间。③纯化的原代细胞制细胞浓度为1～5×106个/mL的细胞悬液,送山东大学医学院免疫实验室PI染色后,流式细胞仪检测细胞周期,以联机专用软件分析结果。④制原代细胞细胞爬片,选取克隆样生长的细胞以釉原蛋白抗体为一抗,用0.1mol/L的PBS液替代一抗作对照。免疫细胞化学染色过程按检测试剂盒说明。⑤将纯化后的细胞传代培养。观察分别用胰酶-EDTA和DispaseⅡ两种消化液消化原代细胞后传代细胞存活率,并观察细胞生长状态。结果:1.FGF10在大鼠切牙颈环区组织分布的免疫组织化学研究:出生2-3d大乳鼠切牙牙胚组织切片HE染色:可见清楚的颈环结构。FGF10免疫组织化学染色,可见牙乳头细胞胞浆、颈环内釉上皮层细胞基底膜及前成牙本质细胞胞浆内出现棕黄色着色的阳性表达,PBS代替一抗的对照组阴性表达。2.大鼠切牙颈环上皮细胞的生物学特性①大乳鼠切牙颈环上皮细胞的分离培养和纯化:从出生2-3d大乳鼠头部剪取下颌骨,置于体视显微镜下获得完整的下切牙牙胚。经消化处理后获得的颈环组织在加入20%胎牛血清的DMEM/F-12培养基中培养培养24小时后,可观察到少量细胞游出组织块,主要是成纤维样的细胞。培养第2天,上皮样细胞成片生长,可见正在分裂的细胞。成纤维样的细胞呈长梭形间杂其中,上皮细胞被成纤维样细胞包围,呈“岛”样分布。经2-3次0.25%胰酶消化,成纤维样细胞被完全除去,贴壁细胞全部是上皮细胞,长满后细胞为多边形,密集排列呈“铺路石”样,能够形成较大的克隆,胞浆丰富,胞核大。②细胞生长曲线:从细胞生长曲线上可以看出细胞的生长过程经历了潜伏期、对数生长期、停滞期（又称平台期）。3d左右进入对数生长期,这时细胞增生活跃、活力旺盛,细胞数量呈指数增长;大约在7d,细胞进入停滞期,生长速度逐渐减慢。细胞群体倍增时间为42.34h。③原代细胞流式细胞仪检测结果:细胞在G1期86.7%,G2期2.67%,S期10.7%。④纯化大乳鼠切牙颈环上皮细胞釉原蛋白抗体免疫细胞化学染色:纯化的大乳鼠切牙颈环上皮细胞,以釉原蛋白为一抗进行免疫细胞化学染色可见细胞核及胞浆棕黄色阳性表达,PBS代替一抗的对照组阴性表达。⑤纯化大乳鼠切牙颈环上皮细胞的传代:0.24%DispaseⅡ消化传代的细胞存活率为69.23%,0.25%胰酶-0.02%EDTA消化传代的存活率为33.67%。χ2检验,p＜0.005,存活率差异非常显著。观察可见胰酶-EDTA消化后的细胞贴壁能力差,增殖缓慢,4d见贴壁生长的存活细胞没有形成较大的细胞团:DispaseⅡ消化后的细胞贴壁后4d可见克隆状生长形成细胞团。至7d细胞增殖变缓慢,细胞团周围细胞密度较低区域细胞呈宽大的不规则形态。结论:1.颈环组织免疫组织化学染色结果显示:颈环上皮细胞基底膜和牙乳头细胞胞浆内出现棕黄着色的阳性表达,推测FGF10在间充质来源的牙乳头组织和外胚层来源的颈环组织之间的相互诱导作用中起一定作用。2.颈环上皮细胞在体外培养条件下,细胞为多边形,密集排列呈“铺路石”样,能够形成较大的克隆,胞浆丰富,胞核大。原代颈环上皮细胞生长、增殖活跃,细胞倍增时间为42.34h。细胞在3-7天进入对数生长期,后续实验应选择这一时期的细胞。3.原代颈环上皮细胞86.7%处于G1期,有较强增殖潜力,增殖周期长。结合本实验细胞生长特点,所分离纯化的颈环上皮细胞符合干细胞特征,具备成为种子细胞的能力。4.颈环上皮细胞抗釉原蛋白免疫细胞化学染色呈阳性,细胞胞浆和胞核内出现棕黄着色的阳性表达,提示原代颈环上皮细胞能够分泌釉原蛋白,具有向前成釉细胞/成釉细胞分化的潜能。5.DispaseⅡ消化的细胞存活率高、细胞生长好。但至第7天时细胞增殖变缓,细胞形态呈宽大的不规则状,其原因可能与细胞缺乏相关刺激因子有关,据本实验结果推测FGF10是其中之一。