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广谱Bcl-2蛋白抑制剂,即至少拮抗Bcl-2和Mcl-1两种抗凋亡蛋白的双靶点Bcl-2抑制剂,已经证明是最具治疗潜力的靶向抗癌药物候选分子。本研究以Bcl-2/Mcl-1蛋白双靶点的小分子抑制剂S1(3-硫吗啉基-8-氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯-9-腈)为着眼点,通过构效关系研究,对比了一系列S1的衍生物与Bcl-2和Mcl-1蛋白亲和力的不同,探测了Bcl-2和Mcl-1蛋白的BH3结构域的三维尺度的差异；所获得的结论指导合成了更多、更高效的广谱Bcl-2蛋白抑制剂类抗肿瘤候选药物分子。小分子S1已证明是一个高效特异的Bcl-2/Mcl-1蛋白双抑制剂；功能和结构研究均表明S1结合于Bcl-2和Mcl-1的BH3结构域,其羰基分别与Bcl-2蛋白的R146和Mcl-1蛋白的R263形成氢键；S1的硫吗啉基团占据两个蛋白的p2口袋,氰基伸向两个蛋白的p4口袋。在此基础上,首先利用不同空间位阻的基团取代S1的硫吗啉基团,设计合成A、B系列22个化合物。通过构效关系研究,分别从宽度和长度探测了Bcl-2与Mcl-1两个蛋白p2口袋的三维尺度的差异。荧光偏振实验(FP)及细胞毒实验(MTT)结果显示：对于Mcl-1蛋白,含间甲氧基苯基的2e(3-(3-甲氧基苯氧基)-8-氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯-9-腈)的Ki值为375 nM,相对于含对甲氧基苯基的2f(3-(4-甲氧基苯氧基)-8-氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯-9-腈,Ki=122 nM)无显著下降；而对于Bcl-2蛋白,2e的Ki值为16.1μM,相对于2f (Ki=304 nM)高达50倍降低,几乎失去所有细胞活性,提示：Mcl-1的p2口袋要比Bcl-2蛋白的p2口袋宽。而含4-特戊基苯氧基的4g(3-(4-特戊基苯氧基)-8-氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯-9-腈)对Bcl-2蛋白的Ki值为355 nM,而对Mcl-1的Ki值降至1.38μM,提示：Bcl-2蛋白的p2口袋比Mcl-1的长。基于此发现,设计并合成3-(4-仲丁基苯甲氧基)-8-氧-8H-苊并[1,2-b]-9-腈(4h),FP实验结果表明它对两个蛋白都具有比S1更高的亲和力(Ki vs Mcl-1=24 nM、Ki vs Bcl-2=158 nM),并且在HL-60、K562与MCF-7癌细胞系中展现出5 nM左右的细胞毒性。通过Fragment-Based药物设计研究,在S1的氰基位置进行分子生长,设计合成C系列5个化合物,探测Bcl-2与Mcl-1蛋白p4口袋的空间结构的差别。酶联免疫吸附(ELSIA)实验结果显示：这一系列化合物对Bcl-2蛋白的结合能力提高了20-30倍,而对Mc!-1蛋白只提高了7-10倍；构效关系分析结合蛋白结构分析表明：Mcl-1蛋白的p4口袋可能更加平坦和裸露,更不易被小分子占据。基于此发现,设计并合成3-(4-异丙基苯氧基)-9-(3-苯基丙氨基)-8H-苊并[1,2-b]吡咯-8-酮(7b)。ELSIA实验结果表明7b对Mcl-1与Bc-2蛋白的ICso值分别为15与9 nM,显著优于S1,尤其是对Bcl-2蛋白的亲和能力显著提高。