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蚓激酶(Lumbrokinase)是从蚯蚓中提取的具有纤溶和溶栓活性的多酶组分。1991年由Mihara等首次分离并命名。目前已有多种蚓激酶制剂，其商品名为普恩复、百奥、博洛克及溶栓胶囊等，主要用于缺血性脑病、冠心病和心肌梗死等心脑血管疾病的治疗。最近Fan等发现蚓激酶的一种组分(EFE-Ⅲ-1)可透过小肠上皮吸收并在循环系统中保持其生物学活性，表明蚓激酶具有进一步研究和开发的价值。到目前为止，虽然蚓激酶基因已被克隆，但并没有表达出具有活性的蚓激酶蛋白的报道。实现蚓激酶的表达进而通过制备乳腺生物反应器大量获得表达产物，对于蚓激酶的研究及产品的开发有重要意义。
动物乳腺生物反应器(Mammaryglandbioreactor)技术属于转基因动物技术具体应用的一个方面，是指利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物，指导外源基因在转基因动物的乳腺中表达，并从动物的乳汁中获取重组蛋白。1987年，Gordon等首先从转基因小鼠的乳汁中获得了人类tPA蛋白。此后的研究证实，动物乳腺具有广泛表达外源基因的能力，一些在临床上有重要应用的蛋白类药物如α-1-抗胰蛋白酶、tPA、乳转铁蛋白及蛋白C等相继在动物乳腺中得以表达，其中一些表达产物已进入了临床应用。制备乳腺生物反应器的方法与制备转基因动物的技术一致，有显微注射技术、精子载体技术、逆转录病毒感染技术及体细胞核移植等。其中主要使用的是显微注射技术。显微注射技术存在着成本高、周期长、转基因效率低及目的基因随机整合等不足。体细胞核移植方法虽然代表了制备乳腺生物反应器的趋势，但对实验条件及实验室整体研究水平的要求较高，很多实验室不具备这样的条件。目前已有利用逆转录病毒感染制备乳腺生物反应器的方法，此方法对实验条件的要求相对较低，同时实验成本不高，有可能成为一种较为实用的方法。本实验对逆转录病毒感染的方法进行了尝试，在目的基因的选择上使用人工合成的蚓激酶基因。前期实验已证实蚓激酶基因可以在山羊乳腺中暂时表达，这在一定程度上可以反映目的基因在转基因动物乳腺中的表达情况。本实验期望通过制备重组逆转录病毒并利用重组病毒感染乳腺细胞的方法实现蚓激酶基因在山羊乳腺的表达。
为了减少培育转基因大家畜的盲目性，在建立大家畜乳腺生物反应器之前，都要对所用目的基因的表达性能进行鉴定。目前，鉴定和筛选乳腺表达载体的方法主要有三种：乳腺细胞表达法、动物乳腺暂时表达法及制备转基因小鼠乳腺生物反应器模型。乳腺细胞表达法虽然简便、客观，但不能完全反映动物在生理条件下的真实情况。动物乳腺暂时表达法操作简便，能部分反映动物在生理条件下的表达情况，但仍存在表达时间短、表达量与注射剂量有关等不足，通常用于对所构建的乳腺表达载体的表达效率进行初步的评估。制备转基因小鼠虽然周期较长且成本较高，有时也不能完全反映制备的转基因大家畜的表达情况，但由于小鼠的繁殖周期短，产仔率高，可在整体水平上研究目的基因的表达情况，因此制备转基因小鼠仍是评估乳腺表达载体所普遍采用的方法。本实验在实现了蚓激酶基因暂时表达的基础上，采用常规的显微注射技术制备蚓激酶转基因小鼠，为下一步制备蚓激酶转基因大家畜的工作打下了基础。
材料和方法1.1实验动物纯种波尔山羊及昆明种小白鼠。
1.2菌株、质粒和细胞株E.coliDH5α为本室保存。哺乳动物表达载体pcDNA3，Invitrogen公司。载体pGEMT-bCP，含有山羊β-酪蛋白基因启动子；载体pMD18T-LK，含有人工合成的蚓激酶基因cDNA；逆转录病毒载体pLNC-LacZ，均为前期工作所构建并保存。PA317和NIH3T3细胞株购自中国科学院上海细胞研究所。
1.3蚓激酶基因在山羊乳腺的暂时表达1.3.1构建包含山羊β-酪蛋白基因启动子及人工合成蚓激酶基因cDNA的乳腺表达载体并使用碱裂解法大量制备。
1.3.2通过直接注射将载体DNA导入泌乳期山羊乳腺。
1.3.3使用纤维蛋白平板法检测乳汁中蚓激酶表达产物的活性。
1.4重组逆转录病毒载体介导的蚓激酶基因在山羊乳腺的表达1.4.1构建包含山羊β-酪蛋白基因启动子及人工合成蚓激酶基因cDNA的重组逆转录病毒载体。
1.4.2利用PA317细胞包装所构建的重组逆转录病毒载体。
1.4.3使用PCR技术鉴定克隆细胞株中目的基因的整合。
1.4.4在NIH3T3细胞上测定重组逆转录病毒的滴度。
1.4.5通过直接注射将重组逆转录病毒导入临产前山羊乳腺。
1.4.6使用纤维蛋白平板法检测乳汁中蚓激酶表达产物的活性。
1.5蚓激酶转基因小鼠的制备
1.5.1制备显微注射用DNA。
1.5.2利用常规显微注射技术制备蚓激酶转基因小鼠。
1.5.3通过PCR及Southern杂交鉴定蚓激酶转基因鼠及其后代。
1.5.4使用纤维蛋白平板法检测转基因鼠乳汁中蚓激酶表达产物的活性。
结果2.1蚓激酶基因在山羊乳腺的暂时表达结果构建了包含山羊β-酪蛋白基因启动子和蚓激酶基因cDNA的乳腺表达载体pBLK。通过直接注射将其导人山羊的乳腺组织并检测乳汁中蚓激酶表达产物的活性。结果显示蚓激酶基因可以在山羊乳腺中暂时表达。注射后6-9h的表达量最高，达到2.0×105U/L，并持续表达至60h。重复注射对表达结果无影响。
2.2重组逆转录病毒载体介导的蚓激酶基因在山羊乳腺的表达结果构建了包含山羊β-酪蛋白基因启动子及人工合成蚓激酶基因cDNA的重组逆转录病毒载体pLNBLK。通过脂质体介导的方法将其转染逆转录病毒包装细胞PA317，经G418加压筛选，获得产毒细胞克隆。PCR鉴定证实目的基因已整合入产毒细胞基因组。在NIH3T3细胞上测定的重组病毒滴度为2×104～1×105CFU/ml。将产毒细胞上清直接注入临产前山羊的乳腺组织，待产羔后采集乳汁并测定蚓激酶表达产物的活性，结果表明乳汁中有蚓激酶的表达，且产羔后第45日，乳汁中表达产物的纤溶活性无明显下降。
2.3蚓激酶转基因小鼠的制备结果使用SalⅠ和PvuⅡ酶切乳腺表达载体pBLK，得到含有全部表达盒的DNA片段，采用常规显微注射技术将其导入小鼠受精卵的雄原核。共注射800枚卵，将注射后存活的约500枚卵移植到29只假孕母鼠输卵管内，其中11只母鼠怀孕，产仔43只。经PCR及Southern杂交鉴定，3只为转基因小鼠。将存活的2只转基因小鼠与正常小鼠交配，所生仔鼠中均检测出转基因后代，表明转入的目的基因能正常传代。使用纤维蛋白平板法检测转基因鼠乳汁中目的基因的表达情况，未测定出蚓激酶的活性。
结论3.1构建了蚓激酶乳腺表达载体，通过直接注射将载体导入泌乳期山羊乳腺，实现了蚓激酶基因在山羊乳腺的暂时表达。
3.2构建了蚓激酶重组逆转录病毒载体，通过逆转录病毒载体的介导实现了蚓激酶基因在山羊乳腺的表达。
3.3制备了蚓激酶转基因小鼠且转入基因能够正常传代。