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在光学显微镜指导下对切片和染色体进行显微操纵来获取少量同类细胞或单条染色体是生物学中常用的分离技术之一,但随着基因组计划为人们提供了几乎全部的DNA序列之后,单条染色体或单个细胞水平提供的综合性信息已经不能满足对基因功能和状态研究的需求,人们更渴望了解基因表达和调控的有关信息,及其在染色体(或染色质)上随时间和空间变化活动的情况,进而了解基因在核内不同时空状态下调控和相互作用的状态。采用离体破碎细胞抽提DNA的方法只能得到大量基因活动的平均信息,而原位显微分离的办法又受到光学显微镜分辨能力的限制,很难得到染色体上或细胞核内局部位置的的DNA片段。荧光示踪的办法能够显示单个基因在细胞内的位置及活动状态,但仅限于观察,纳米级分辨率的分离技术目前仍然比较匮乏,因此迫切需要发展新的集高分辨率成像、定位、操纵分离与一身的新技术和新方法,以定位获取染色体上或细胞核内特定位置的DNA片段用于分析。
作为纳米科技的核心技术之一,基于AFM的纳米操纵技术有望为上述问题的解决提供一种可能的方案。AFM是集纳米成像和纳米操纵功能于一身的新一代显微镜,在实现了针对单个生物分子如DNA、蛋白质这样简单体系的纳米操纵之后,人们尝试把AFM的研究对象拓展到更复杂的生物体系,以促进有关对象精细结构和功能的深入了解。不过对于生物切片,虽然前人利用AFM有一些初步的成像工作,但基于切片的纳米操纵未见报道。而且前染色体的AFM分离都是针对已知序列的,且多在液体中实现,难以避免游离DNA带入的污染。Contact mode下的切割精度不够高,容易造成样品损伤,要摊广使用在技术层面尚有待发展。
本实验室多年来从事AFM的纳米成像和操纵研究,在利用AFM操纵单个生物分子已经取得了标志性的成果,而且积累了一系列特色技术,在AFM方法学上形成了自身的优势,为进一步将AFM操纵技术应用到切片和染色体的纳米成像和纳米操纵的研究奠定了基础。
本论文主要目标是发展切片和染色体的纳米操纵方法学,包括样品制备、纳米级成像和定位分离的方法,并建立针对分离产物的系统分析方法。技术路线包括适合于AFM操纵的样品制备、形态分析、定位切割分离以及对拾取产物的分子生物学分析等。本论文的研究分为三个方面:(1)发展染色体的AFM定位纳米分离并获取其中DNA片段的技术；(2)发展适合AFM高分辨成像和定位的切片样品制备方法和切片上单个细胞核及其内部的纳米操纵技术；(3)建立针对AFM纳米分离产物的有效分析方法。
本论文的工作取得了以下主要进展:(1)选择3T3细胞的染色体经AFM成像后,定位染色体上的局部位置,建立了基于AFM“negative liftmode”的染色体纳米切割和分离方法,能够定位获取染色体局部位置的DNA片段。后续分析可利用简并引物通过DOP—PCR及多重扩增来放大分离产物中低模板量的目标DNA片段。电泳结果显示染色体纳米分离样品被扩增出多条清晰的条带。通过割胶回收目标条带,TA克隆并测序,进行BLAST比对后显示,测序结果与数据库中小鼠对应染色体上的部分序列存在99％以上的相似性,表明我们利用AFM在空气中对染色体的定位纳米分离获得了成功。
(2)对切片样品制备方法的研究表明,选择厚度在60 nm左右正面朝上的超薄切片进行AFM成像能获得最高的分辨率和最佳的反差,可以显示细胞内部的超微结构,如细胞核、核膜以及核仁、近核周的异染色质等等,还能够分辨内质网、线粒体和溶酶体等细胞器。通过15～30 min的二甲苯处理适当去除石蜡切片表面的部分石蜡,可以暴露部分组织和细胞的结构,提高成像水平,分辨细胞内如细胞膜、细胞核等的亚细胞结构以作定位和分离的基础。
(3)对切片样品 AFM纳米分离的研究表明,基于negative lift mode,通过控制针尖下压的深度,并调制压电陶瓷在Z方向上的驱动电压,可以实现针尖对切片表面既定位置的切割和分离。分离产物包含多种成分,对其中低模板量的DNA片段进行扩增时,可利用简并引物通过DOP-PCR、等温扩增等方法,并优化扩增程序,电泳结果显示能对分离产物中的DNA片段实现扩增,表明我们对切片上细胞内的纳米切割和分离获得初步成功。
本论文的研究将AFM操纵功能从纯粹的DNA和蛋白的简单体系拓宽到了更为复杂的染色体和生物切片上,加深了人们对AFM操纵功能的理解,并将AFM操纵的方法学研究推广到一个新的层次。本论文对染色体纳米分离和分析的系统研究有望为染色体分离技术的发展开拓一个新的方向,在切片样品制备、成像和定位分离所发展的技术,可以为切片的AFM研究提供可靠的支持。