豚鼠耳蜗离体外毛细胞Ca2+转运机制的研究

• 作 者: 陈世琴
• 发表日期: 2011年期
• 关键词: 豚鼠 外毛细胞 钙离子 非损伤微测技术 分离

目的:观察发育过程中的豚鼠听性脑干诱发电位（Auditory Brainstem Responses ABR）阈值水平。探索豚鼠耳蜗外毛细胞（Outer Hair Cells,OHCs）的快捷分离方法并观察其活力,为OHCs的电生理实验提供快捷的实验方法。观察发育过程中豚鼠耳蜗外毛细胞Ca²⁺转运现象并探讨其转运机制,为临床听觉系统疾病的预防和治疗提供理论依据。方法:借助听力学检测仪器对不同年龄的豚鼠进行ABR阈值检测;采用机械与胶原蛋白酶消化相结合的方法快速分离耳蜗OHCs,并在倒置相差显微镜下观察其活力;借助非损伤微测技术,检测静息状态下的耳蜗单离OHCs的Ca²⁺流速,并观察尼莫地平对Ca²⁺流速的影响。结果:1、产后1天豚鼠较3天、7天和成年组豚鼠的ABR阈值高,高约8dB SPL（P<0.05 ANOVA）。产后3天、7天组豚鼠的ABR阈值与成年豚鼠的阈值无明显差异（P>0.05 ANOVA）,即3天组豚鼠ABR阈值已达到成年豚鼠听力水平。2、本实验所采用的分离方法可快速分离出足够数量、活性良好的耳蜗OHCs,其贴壁所需的时间较短,分离后静置7分钟即观察到贴壁。不同形态的OHCs在正常细胞外液中的存活时间不同,胞体较短的能存活3小时左右,胞体较长的能存活6-7小时。3、静息状态下豚鼠耳蜗单离OHCs和基底膜片段上的OHCs具有4种类型的Ca²⁺流动:OHCs头部Ca²⁺内流,尾部外排（Ⅰ型）。OHCs头部Ca²⁺外排,尾部内流（Ⅱ型）。OHCs头部和尾部Ca²⁺均内流（Ⅲ型）。OHCs头部和尾部Ca²⁺均外排（Ⅳ型）。然而在整个耳蜗基底膜上仅发现Ⅰ型和Ⅲ型Ca²⁺流动趋势。且尼莫地平对耳蜗静息状态下OHCs的Ca²⁺流速具有明显的抑制作用,OHCs头端的Ca²⁺的抑制率可达76.78%,尾端的抑制率可达100%。4、发育过程中的豚鼠耳蜗单离OHCs的Ca²⁺流速逐渐增大。产后1天豚鼠耳蜗单离OHCs的Ca²⁺流速明显小于正常成年豚鼠的Ca²⁺流速（P<0.05 ANOVA）,大部分的产后3天、7天豚鼠耳蜗单离OHCs的Ca²⁺流速已接近成年水平（P>0.05 ANOVA）。结论:1、采用机械分离结合酶消化的方法分离耳蜗OHCs,可获得足够数量的形态和活性良好的、存活时间较长的OHCs,可满足大多数电生理实验的要求。2、成年豚鼠耳蜗OHCs在静息状态下存在Ca²⁺流动,并且趋势是多样的,但其主导趋势尚不明确,仍需进一步研究。3、发育过程中的豚鼠耳蜗单离OHCs的Ca²⁺流速逐渐增大。产后3天即可测到明显的Ca²⁺流速,并且大部分已达到正常成年豚鼠Ca²⁺流速的水平,为我们进一步研究其离子转运机制奠定了基础。