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本研究的目的：(1)用pET29b表达载体在大肠杆菌中高表达结核分枝杆菌的RmlA蛋白质；(2)采用亲和层析技术纯化RmlA蛋白质；(3)用SDS-PAGE和Westernblot鉴定所纯化的RmlA蛋白质；(4)建立测定RmlA酶活性的方法；(5)确定RmlA酶的最佳反应条件并测定RmlA酶的反应动力学常数。
本研究所获得的结果：1.诱导RmlA蛋白质在大肠杆菌BL21(DE3)中表达用不同条件(IPTG浓度、诱导温度及诱导时间等)诱导rmlA基因的表达。用超声方法破碎诱导的BL21(DE3)，对上清和沉淀组分进行SDS-PAGE分析。结果表明RmlA酶蛋白在BL21(DE3)中得以表达，并且可以以可溶形式存在于上清中。
2.用Westernblot方法鉴定RmlA蛋白质将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，用抗多聚组氨酸的单克隆抗体及偶联碱性磷酸酶的马抗小鼠IgG二抗进行检测。结果表明，所表达的RmlA蛋白质为rmlA基因产物。
3.采用亲和层析技术纯化RmlA蛋白质利用pET表达载体上的组氨酸标记，采用组氨酸-Ni2+亲和层析技术，纯化RmlA蛋白质。并且用考马斯亮蓝法进行蛋白定量，结果表明纯化的第1mlRmlA蛋白质的浓度为635.71μg/ml。
4.用SDS-PAGE和Westernblot鉴定所纯化蛋白的纯度将纯化后收集的前3ml样品进行SDS-PAGE和Westernblot分析，结果表明纯化的蛋白质为RmlA蛋白质，而且不存在其它杂蛋白。
5.建立测定RmlA酶活性的方法(1)将反应底物D-Glc-1-P和dTTP与纯化的RmlA酶蛋白在37℃反应30分钟，用500mMKH2PO4终止反应，然后采用高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)，应用C18层析柱，在254nm处检测到dTTP的减少和dTDP-D-Glc的生成，表明纯化的RmlA蛋白质具有酶活性。
(2)将反应底物D-Glc-1-P和dTTP与不同浓度的RmlA酶蛋白在37℃反应不同的时间，用500mMKH2PO4终止反应，然后用HPLC和C18层析柱在254nm处检测产物dTDP-D-Glc的生成。绘制酶浓度曲线和反应时间进程曲线，结果表明RmlA酶蛋白反应初速度的酶浓度范围是1.27μg/ml，时间范围是5min。
(3)在酶反应初速度范围，即酶浓度为1.27μg/ml，反应时间为5min，分别改变反应温度(从20℃到90℃)和反应的pH值，用HPLC和C18层析柱检测产物dTDP-D-Glc的生成量。结果表明RmlA酶蛋白的最适反应温度是40℃，最适pH值为8.0。
6.测定RmlA酶蛋白的反应动力学常数采用最佳的酶反应条件，即在40℃，pH值为8.0，酶浓度为1.27μg/ml，反应时间为5min，分别用不同的底物浓度，进行酶促反应，然后用500mMKH2PO4终止反应并用HPLC和C18层析柱在254nm处检测产物dTDP-D-Glc的生成量。用双倒数作图法得出RmlA的Km值和Vmax。对于底物dTTP，Km=0.019mmol/L，对于底物D-Glc-1-P，Km=0.870mmol/L。Vmax为160.56mmol/(L·min)。
结论：(1)用大肠杆菌BL21(DE3)所表达的可溶性结核分枝杆菌RmlA蛋白质为纯化RmlA蛋白质并研究其酶促反应动力学特性提供了保障。(2)建立了精确的RmlA酶活性测定方法，确定了RmlA的最佳反应条件并测定了RmlA酶蛋白的反应动力学常数Km和Vmax。(3)RmlA酶活性测定方法可用来筛选酶抑制剂，以研发抗结核新药。