大蒜乙醇提取物对腐败芽孢杆菌及其生物膜的抑制作用

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芽孢杆菌是预浸泡豆杆的优势腐败菌,具有产耐热芽孢和生物膜的特性,能够引起产品快速腐败,导致产品感官品质与营养品质的降低,给产品流通带来严重影响。大蒜富含有机硫化物等活性成分,具有广谱抑菌、杀菌活性,在食品腐败芽孢杆菌的安全控制领域具有良好的应用价值。本研究以4株腐败芽孢杆菌为对象,分析4株腐败菌的生物膜形成能力与形成条件,评价大蒜乙醇提取物对细菌菌体增殖和生物膜的抑制效果,及对细菌生物膜的清除能力,并进一步探讨了大蒜乙醇提取物对细菌菌体繁殖和生物膜形成的抑制机理。主要研究结果如下:1、大蒜乙醇提取物对芽孢杆菌菌体增殖的抑制与机理。采用气相色谱-质谱法分析正己烷浸提后的大蒜乙醇提取物主要组成,结果表明二硫化合物相对含量为70.08%。采用牛津杯法和二倍稀释法测定大蒜乙醇提取物的抑菌杀菌作用效果,结果表明3000 mg/m L的大蒜乙醇提取物对菌株DY1a、DY1b、DY2a和DY3产生的抑菌圈分别为31.7、25.7、30.3、30.0 mm,大蒜乙醇提取物对4株细菌的最小抑菌浓度(MIC)为30 mg/m L,最小杀菌浓度(MBC)分别为240、480、120、60 mg/m L。生长曲线分析显示,30 mg/m L大蒜乙醇提取物可完全抑制细菌在50 h内菌体增殖。30 mg/m L大蒜乙醇提取物对菌株DY1a和DY1b的胞外蛋白酶活性抑制率为47.3%和15.6%,而对菌株DY2a与DY3胞外蛋白酶活性影响不明显。代谢活性研究结果显示,细菌在30 mg/m L大蒜乙醇提取物处理下仍然具有活性。此外,30 mg/m L大蒜乙醇提取物处理5 h后,处理组胞外培养液的碱性磷酸酶活性、电导率和β-半乳糖苷酶均显著高于未处理对照(P<0.05),表明细胞膜结构受到严重破坏。扫描电镜观察发现,大蒜乙醇提取物处理导致菌株细胞表面出现皱缩、孔洞式塌陷和破裂。2、芽孢杆菌生物膜形成能力与形成条件。解淀粉芽孢杆菌DY1a和DY1b能够在TSB培养基气-液交界面形成生物膜,而枯草芽孢杆菌DY2a和DY3形成生物膜能力很弱。解淀粉芽孢杆菌DY1a和DY1b生物膜形成量在培养48 h达到最大值,在TSBS培养基中的形成量显著高于其他培养基(P<0.05),培养环境p H值7.0,温度37℃,初始接种量为5~7 lg CFU/m L最有利于生物膜形成。3、大蒜乙醇提取物对芽孢杆菌生物膜的抑制与清除。在TSBS培养基中添加不同浓度大蒜乙醇提取物,对解淀粉芽孢杆菌DY1a和DY1b的生物膜形成情况、生物膜形成量与生物膜内活菌数量进行测定。结果显示,大蒜乙醇提取物可显著抑制解淀粉芽孢杆菌生物膜的形成量,15 mg/m L大蒜乙醇提取物对生物膜内的活菌数抑制率分别为62.0%与43.6%。大蒜乙醇提取物能够抑制解淀粉芽孢杆菌DY1a和DY1b的运动能力,15 mg/m L大蒜乙醇提取物对2株细菌泳动能力抑制率分别为100%和33.27%,丛集能力抑制率分别为100%和92.0%,颤搐能力抑制率为78.6%和71.6%。生物膜清除实验结果发现,大蒜乙醇提取物处理的生物膜形成量显著高于未处理对照(P<0.05),表明大蒜乙醇提取物不能清除解淀粉芽孢杆菌已形成的生物膜,反而可促进生物膜的再生长。生物膜内代谢活性分析发现,300 mg/m L大蒜乙醇提取物使菌株生物膜代谢活性(OD490 nm值)提高了1.6左右。生物膜中蛋白质和多糖含量结果表明,300 mg/m L大蒜乙醇提取物处理显著提高了生物膜中蛋白质含量,蛋白质/多糖比值分别提高了2.5和2.6倍。
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