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近年来,随着人类基因组和多种模式生物基因组测序工作的完成,发现非编码蛋白基因数量远远超过编码蛋白基因数量,且越高等的生物,不编码蛋白质的部分在其基因组中所占的比例越大。不编码蛋白的RNA分子即为非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)。目前,与不断活跃涌现的ncRNA分子相比,对其功能研究却进展缓慢。ncRNA在生命活动中起着非常重要的作用,如参与染色质结构的修饰,蛋白质合成,RNA的转录和转录后加工的调控等。因此,对ncRNA的功能研究越来越受到人们的重视。基因芯片则以其快速、高通量、准确性高等突出优点成为研究基因功能不可缺少的工具。
本实验以家蚕为模式生物,在实验室前期鉴定的一大批新ncRNA基础上,利用Microarray技术及Northern杂交实验进一步验证其在家蚕变态发育过程中的表达情况。
通过Microarray技术分析各种ncRNA在家蚕两个不同发育转变期(卵到一龄幼虫、五龄幼虫到蛹期)的表达情况,发现绝大多数ncRNA在时空上具有不同的表达水平,说明这些ncRNA在体内的产生和降解受到了严格的调控,揭示它们在生物体某些生命活动中发挥着重要的作用。同时对其数据进行统计分析发现有14个ncRNAs在家蚕两个不同发育转变期有显著差异表达。通过Northern杂交实验验证这些有显著差异表达的ncRNA在家蚕两个不同发育转变期的表达情况。在家蚕由卵向一龄幼虫转变时有显著差异表达的ncRNA中,发现大多数ncRNA在卵中的表达量相对多于一龄幼虫期。而在家蚕由五龄幼虫向蛹期转变过程中,ncRNA的表达量多富集于蛹期。
Northern Blot及半定量RT-PCR结果发现,位于基因内含子区的ncRNA一般随着宿主基因一块转录,作为pre-mRNA前体的一部分经转录后的剪接加工作用从内含子中释放出来,或随着pre-mRNA的降解而独立出来。如Bm-86与其宿主基因在卵向一龄幼虫期转变时表达模式具有一致性,而由五龄幼虫向蛹期转变时则相反,说明内含子起源snoRNA可通过不同的剪切机制产生,并且在家蚕不同发育期发挥不同的调控作用。另外,一些从基因反义链上转录出的ncRNA能与其正义链基因形成“正义-反义基因对”,在不同条件下对正义基因的表达起着促进或阻遏作用。如Bm-151和Bm-152在家蚕由卵向一龄幼虫期转变时,其表达模式与正义基因相反,它们对正义基因的表达可能起负调控作用,而Bm-151在由五龄幼虫向蛹期转变时则与正义基因的表达模式相一致,故其可协助正义基因的表达。对于转录自基因间区的ncRNA,如Bm-101,它与下游基因BGIBMGA009516-TA的第一个外显子有63bp重叠区。研究发现,Bm-101的表达量多富集于蛹期,而与其串联的下游基因只在五龄幼虫期中表达,由此说明在不同的发育时期该串联结构能产生不同的转录产物,对该基因分析发现其有折叠成C/D box snoRNA的趋势,这也可能揭示了snoRNA的最新进化形式。