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脆性X智力低下1号基因1(fragileXmental retardationgene1, Fmr1)是一个高度保守的基因, cDNA全长4661bp,位于染色体Xq27.3,由17个外显子和16个内含子组成，长38 Kb。该基因的5端非翻译区有一个（CGG)n重复序列，该序列上游250bp处有一个基因启动子，即CpG岛。当(CGG)n重复数在40~60之间时为Fmr1基因中间突变，CpG岛无异常甲基化，个体常无异常表型或具有轻微的行为问题；当（CGG) n重复数在50~200之间时为Fmr1基因前突变, CpG岛亦无异常甲基化，个体常出现脆性X相关性震颤/共济失调综合征（fragile X associated tremorand ataxia syndrome,FXTAS)和卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）；当（CGG) n重复数超过200时为全突变,常伴有CpG岛异常甲基化,使Fmr1 mRNA的翻译受抑制,即脆性X智力低下蛋白（fragileX mental retardation protein，FMRP）表达减少、缺失或功能丧失，从而引起脆性X综合征（fragile X syndrome，FXS）。研究发现（CGG) n重复数与绝经年龄有关，（CGG) n重复数为80~200之间，绝经年龄最早，另外Fmr1基因前突变携带者可发生高卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）和早绝经，2l％女性Fmr1基因前突变携带者可发生POF，3％一15％的散发性POF是Fmr1基因前突变携带者，以上提示Fmr1基因可调节女性的生殖功能。Fmr1基因敲除小鼠是在Fmr1基因的第5个外显子中插入了一个新霉素表达片断，从而阻断了500bpDNA片断的扩增，导致FMRP表达的缺失而制备成FXS的动物模型，在该基因敲除小鼠（knockoutmice，KO鼠）及野生型小鼠（wild type mice,WT鼠）的繁育过程中，发现Fmr1基因的缺失会对动物的生产量产生影响，研究也发现KO雄鼠的生育能力和WT小鼠相比是下降的，KO雄鼠与雌鼠合笼后的30min内少数雄鼠没有明显的追逐、环抱及性行为。因此本实验前半部分将通过观察小鼠的合笼情况来比较KO纯合子、KO杂合子及WT雌鼠的生殖功能，探讨Fmr1基因缺失会对雌性小鼠的生殖功能产生哪些影响？若Fmr1基因对生殖功能有影响，那么它是通过何种途径来调控生殖功能的呢？FMRP是一种选择性RNA结合蛋白，通过其功能域可以选择性地与包括自身mRNA及与神经发育、树突可塑性、配子生成等各种mRNA相结合，对RNA转运、mRNA的稳定性起作用，在脑组织中，FMRP可调节其他蛋白的表达，影响突触的发育和神经细胞的可塑性，进而导致FXS患者智力低下和行为问题。在性腺组织中，FMRP在卵巢、睾丸组织中同样高度表达，FMRP可调节卵巢的储备功能，因此我们猜测它的完全或部分缺失可能影响其他调节生殖功能的蛋白的转录和翻译，从而影响生殖功能？神经肽Y(Neuropeptide Y,NPY)是一种肽类物质,广泛分布于哺乳动物的中枢和周围神经系统中，与下丘脑神经内分泌的调节密切相关。NPY可抑制促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）的脉冲式释放；对排卵前的LH峰有促进作用；同时NPY可影响卵巢的血流，调节卵泡的生长，在生殖功能的调节中起重要的作用。本实验将探索KO、WT鼠其下丘脑及周围血中NPY的表达是否有差异？Fmr1基因是否是通过调控NPY的表达而影响雌鼠的生殖功能的？Γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）是中枢的一种抑制性氨基酸类神经递质，可通过下丘脑-垂体-性腺轴影响垂体和性腺的生理机能，也可以通过多巴胺系统抑制黄体生成素（luteinizing hormone，LH）和泌乳素（prolactin， PRL）的分泌，从而调节生殖功能。在对KO鼠的研究中已发现其GABA受体（gamma-aminobutyric acidreceptor，GABAR）的活性是降低的，那么Fmr1基因是否能通过影响GABA或GABAR的活性来影响雌鼠的生殖功能呢？ 目的：本实验比较KO纯合子、KO杂合子、WT雌鼠三者的生殖能力，明确Fmr1基因的缺失是否会对雌性小鼠的生殖功能产生影响，通过免疫组织化学方法、酶联免疫吸附测定法观察NPY、GABA在KO鼠及WT鼠下丘脑及血清的表达，初步探讨Fmr1基因调控雌鼠生殖功能的可能机制。 方法：⑴实验动物：纯合子（-/-）Fmr1基因敲除型（KO纯合子）、杂合子（+/-） Fmr1基因敲除型（KO杂合子）及其纯合子(+/+)野生型(WT) FVB近交系小鼠。⑵动物基因型鉴定：采用PCR法检测实验小鼠的Fmr1基因片段。⑶用于繁殖力试验的成年的KO纯合子雌鼠、KO杂合子雌鼠、WT雌鼠和成年的WT雄鼠，每组至少15只。⑷用于免疫组织化学实验的10周的KO纯合子雌鼠、KO杂合子雌鼠、WT雌鼠，每组至少6只。⑸用于酶联免疫吸附测定实验的10周的KO纯合子雌鼠、KO杂合子雌鼠、WT雌鼠，每组12只。⑺实验方法及观测指标：通过合笼实验观察 KO纯合子、KO杂合子及 WT雌鼠的合笼时间及产仔数；通过苏木素-伊红染色观察三组雌鼠的卵巢组织形态及进行卵泡计数；通过免疫组织化学染色方法测定下丘脑NPY及GABA的表达；通过酶联免疫吸附测定法测定血清NPY的表达。⑺数据及图像的采集：免疫组化结果应用 Olympus- BH22型光学显微镜摄片，每个切片200倍镜下取5个视野，用Image J图像分析软件进行NPY免疫反应阳性细胞计数，用Image Pro Plus6.0图像分析软件进行GABA免疫反应平均光密度值的测定。⑻统计学处理：所有数据采用SPSS16.0软件进行分析，正态分布的计量资料以x±s表示，正态分布资料多组样本的比较采用One-way ANOVA,组间两两比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。 结果：①经基因鉴定，KO纯合子小鼠基因型为（-/-），KO杂合子小鼠基因型为（+/-），WT小鼠基因型为(+/+)。②繁殖力试验结果： KO纯合子雌鼠的产仔数少于WT雌鼠，差异有统计学， P<0.05；三组雌鼠与野生型雄鼠的合笼天数差异均无统计学意义，P>0.05；三组雌鼠相比，其卵巢组织形态未见明显不同；KO纯合子雌鼠的卵泡总数少于WT雌鼠，差异有统计学，P<0.05。③免疫组织化学实验结果：下丘脑室周核、正中隆起、下丘脑外侧区、弓状核、背侧区及腹内侧核均可见NPY阳性细胞的表达，正中隆起、下丘脑弓状核及背侧区这些与生殖调节密切相关的区域，其NPY表达更强烈，三种基因型雌鼠其NPY的表达部位无明显不同，经统计，KO纯合子雌鼠下丘脑NPY阳性细胞计数少于WT雌鼠，差异有统计学，P<0.05；下丘脑弓状核、室周核、腹内侧核背部和腹部以及下丘脑背侧区均有GABA阳性细胞的表达，在下丘脑弓状核和室周核GABA表达更强烈，三种基因型雌鼠其GABA的表达部位未见明显不同。经统计，三种基因型雌鼠其下丘脑GABA的表达量差异无统计学意义，P>0.05。④酶联免疫吸附测定实验结果：三组雌鼠血清NPY的表达量两两比较差异均无统计学意义，P>0.05。 结论：⑴Fmr1基因的完全缺失会引起雌性小鼠生殖功能的下降。⑵Fmr1基因可能是通过下调中枢性NPY的表达来降低雌性小鼠的生殖功能的。⑶GABA可能在Fmr1基因敲除雌鼠生殖功能下降中不起关键性作用。