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免疫细胞是免疫系统最重要的组成成分，其包括造血干细胞、淋巴细胞（如T细胞，B细胞和NK细胞等）、抗原提呈细胞(antigen presenting cell)、粒细胞(neutrophils、eosinophils)、肥大细胞(mast cell)等。某些免疫细胞可通过分泌效应分子而发挥杀伤和免疫调节功能。目前，有关免疫细胞分泌的特性及其调控机制尚不清楚。本文借助现代生物物理学、分子生物学和免疫学方法研究中性粒细胞、肥大细胞和NK细胞的分泌和杀伤机制，获得如下成果: （一）中性粒细胞的分泌特征及其调控机制 1.中性粒细胞分泌的调控 胞内钙及GTPγS均可剂量依赖性地促进中性粒细胞分泌（量和分泌平均速率）;钙离子能较快诱发细胞胞吐，启动分泌的时间较短（约50秒）;GTPγS诱发胞吐较慢，启动分泌的时间较长，约150-200秒。 2.过敏性疾病患者中性粒细胞分泌的调控特征 对过敏性疾病患者，钙离子诱发其外周血中性粒细胞分泌的动力学特性发生改变，而GTPγS诱发的胞吐与正常人无异。提示:过敏性疾病患者外周血中性粒细胞中参与分泌作用的钙相关蛋白可能有别于正常人。 （二）肥大细胞的分泌特征及其调控机制 以RBL-2H3(rat basophilic leukemia cell，RBL-2H3)细胞为模型，采用高分辨率单细胞膜电容检测(membrane capacitance)和光解钙离子释放技术(Flash)，观察糖皮质激素GC(Glucocorticoid，GC)对RBL-2H3细胞分泌的影响。结果表明: 1.GC对RBL-2H3细胞分泌的抑制效应 GC可呈浓度依赖性地抑制RBL-2H3细胞分泌，此抑制效应不被GC-BSA、RU38486(GC核受体拮抗剂)和Actidione（放线菌酮ATI，蛋白合成抑制剂）所阻断。 2.GC抑制RBL-2H3细胞分泌机制 在卵白蛋白(ovalbumin)所诱导的分泌中，GC通过快速抑制RBL-2H3细胞内钙升高而抑制RBL-2H3细胞分泌，且GC并不直接影响RBL-2H3细胞囊泡与质膜的融合。本研究首次发现:GC通过非基因组机制（影响胞内钙离子信号）而抑制肥大细胞(RBL-2H3)分泌。 (三)NK细胞的分泌和杀伤特征及其调控机制 1.NK细胞分泌作用的钙依赖性 以人NK92细胞株为模型，应用膜片钳和细胞成像技术，在电极内灌注不同浓度钙离子刺激NK细胞，发现NK细胞胞吐和分泌呈钙离子浓度依赖性，其EC50约4.5μM，明显低于PMN和肥大细胞，表明NK细胞胞吐和分泌呈高钙敏感性。 2.NK细胞杀伤效应相关的胞吐动力学 (1)以最大钙浓度刺激(300μ M)，NK细胞分泌的膜电容仅为578fF，其分泌幅度明显低于中性粒细胞和肥大细胞。如此低的分泌水平，NK细胞难以发挥连续杀伤靶细胞的功能。GTPγS也可以刺激NK细胞分泌，静息状态下NK膜电容增量如钙离子相似。 (2)用NK细胞敏感的靶细胞(porcine endothelial cell，PEC)刺激NK细胞，在相同钙浓度下，激活的NK细胞比静息状态下其膜电容升高约3.2倍。 (3)比较两种不同状态下NK细胞分泌型溶酶体的胞吐动力学差异，发现PEC不仅增加NK细胞分泌型溶酶体的数目，且加快其分泌。 上述NK细胞胞吐动力学特点与其可连续杀伤靶细胞且无需致敏的功能特征相吻合。 (4)电子显微镜观察，发现PEC可增加分泌型溶酶体数目，在NK细胞与PEC相互接触的界面（免疫突触）可发现分泌型溶酶体极化与集中。为进一步研究这些快速产生的分泌型溶酶体的生物学起源，用EGFP-C1-FasL标记分泌型溶酶体，在TIRF下观察其动态生成过程，其具体的调控机制正在进一步研究中。 3.PKC途径参与分泌型溶酶体产生及分泌 (1)通过EGFP-C1-FasL标记NK细胞分泌型溶酶体，发现PMA作用5-10分钟可使NK细胞荧光明显增强，且分泌型溶酶体数目增多。 (2)对PMA刺激的NK细胞用AO染色或EGFP-C1-FasL标记其分泌型溶酶体，借助三维重建方法构建NK细胞的三维模型，对整个细胞内的颗粒进行计数。结果表明，PMA可使NK细胞内颗粒数比静息状态下明显增多，该作用可被PKC抑制剂所阻断，提示PKC参与分泌型溶酶体生成。 (3)经PEC刺激产生的分泌型溶酶体不被BFA（一种可抑制囊泡丛高尔基体出芽的真菌代谢产物）所阻断，表明这些快速产生的分泌型溶酶体并非由高尔基体所产生。目前，正继续探究这些快速产生的分泌型溶酶体其具体起源的细胞器。 4.NK细胞杀伤作用的调控及其机制 探讨CD2AP(CD2-associated protein)调控NK细胞杀伤的作用及其机制:①RT-PCR和Western Blot发现，NK92表达CD2AP分子;②借助免疫组化和激光共聚焦显微镜技术，确定CD2AP定位于NK92细胞胞浆;③在NK92敏感的靶细胞(PEC)刺激下，发现CD2AP在效/靶细胞间所形成的“免疫突触(immune synapse)”局部发生极化。 结果表明:CD2AP参与NK92细胞分泌型溶酶体的极化和杀伤功能的调控。