大蜡螟病原菌菌株BP-1的鉴定及其杀虫蛋白的分离纯化与毒力测定

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大蜡螟(Galleria mellonella)分布广泛,属于鳞翅目、螟蛾科、蜡螟亚科、蜡螟属昆虫。大蜡螟对中蜂危害严重,主要以幼虫,尤以3-5龄幼虫取食巢脾,使蜂不能封盖,造成蜂群内蜂蛹形成“白头蛹”,不能羽化,即使勉强羽化,幼蜂也会被大蜡螟分泌的丝线困在巢房内,给世界养蜂产业带来了巨大的危害。多年来,国内外研究人员从许多方面研究了大蜡螟的有效防治方法。在自然界中由于大蜡螟主要取食蜜蜂的巢脾,所以在防治方法上要特别注意其对蜜蜂的伤害,因此生物防治是比较理想的选择,目前在生物防治领域中,开发利用最广泛的生防菌剂集中在芽孢杆菌和真菌上,如苏云金芽孢杆菌和绿僵菌等,特别是苏云金芽孢杆菌的广泛使用,它在芽孢形成期间产生的杀虫蛋白晶体对大蜡螟具有毒力。不过长期依赖单一杀虫菌会使大蜡螟产生相当的抗性,导致当前大量使用的生物杀虫剂的效果下降。因此,有必要扩大病原菌的范围,开发新的防治大蜡螟的病原菌。本研究从一头自然病死的大蜡螟尸体中分离到一株病原菌BP-1,通过回复感染大蜡螟老熟幼虫,其致病性符合KOCH定则,该菌的最适生长pH范围是7-8,最适盐浓度是1%,其在培养2h后进入对数生长期,并持续到7h,8h-24h是稳定期。该菌革兰氏阳性,V.P反应阳性;硝酸盐还原阳性;可以水解淀粉;可以使明胶液化;不产生硫化氢;可以利用丙酸盐,柠檬酸盐。能利用葡萄糖,蔗糖,乳糖。结合16SrDNA分子鉴定,确定该菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens).对其发酵上清液的杀虫活性进行了初步测定,显示注射20μL浓度为1.0μg.μL-1的病原菌BP-1发酵上清液于大蜡螟老熟幼虫,24h后的校正死亡率为91.23%±3.04%,每1g人工饲料加100μL病原菌株BP-1发酵上清饲喂大蜡螟初孵幼虫,168h后,校正死亡率为43.25%±4.365%。体重抑制率为59.16%±2.250%,显示病原菌株BP-1具有较强的血腔毒力和胃毒活力。病原菌BP-1的最佳发酵时间为16h。用蛋白酶K处理的发酵上清液进行杀虫活性实验,校正死亡率为8.77%±3.04%,说明具有杀虫活性的物质是存在于细菌上清液中的杀虫蛋白。杀虫蛋白经硫酸铵饱和沉淀得到杀虫蛋白粗提物,经Sephadex G-75凝胶层析出现两个峰,胃毒活力和血腔毒力测定显示峰1为活性峰。将活性峰收集过DEAE-Sepharose FF,仅出现一个峰,此时得到的峰中的蛋白已较纯,每1g人工饲料加100μg该峰冻干粉饲喂大蜡螟初孵幼虫,初步检测其对大蜡螟的胃毒活力,168h后,该峰校正死亡率为63.86%±4.25%,体重抑制率为68.64%±0.4473%,将该峰冻干粉溶解,浓度为1.6μg.μL-1,注射10μL于大蜡螟老熟幼虫,初步检测其对大蜡螟的血腔毒力,24h后,该峰的校正死亡率为93.58%±5.268%。SDS-PAGE电泳表明杀虫蛋白为单链蛋白质,分子质量约为37kD,命名为BA1P37。进一步测定杀虫蛋白BA1P37对大蜡螟幼虫致死中浓度(LC50),24h后,结果显示:杀虫蛋白BA1P37对大蜡螟老熟幼虫具有显著的血腔毒性。LC50为0.457μg.μL-1,即以浓度为0.457μg.μL-1的杀虫蛋白BAlP37来注射大蜡螟老熟幼虫,每头注射10gL可以杀死50%的大蜡螟老熟幼虫,且随着杀虫蛋白浓度的增加,大蜡螟的死亡率逐渐升高,168h的胃毒测定结果显示,LC50为56.973μg.g1,即以56.973μg杀虫蛋白BA1P37加入1g大蜡螟的人工饲料的比例饲喂大蜡螟,可以杀死50%的大蜡螟初孵幼虫,并有明显的体重抑制作用。这些结论为杀虫蛋白BA1P37的应用打下基础。
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