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苦荞苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine mmonia lyase,PAL,EC 4.3.1.5),催化L-苯丙氨酸(L-Phe)上氨基的裂解从而反应生成反式肉桂酸(t-CA),是植物体内连接初级代谢和苯丙烷类物质次级代谢、催化苯丙烷类物质代谢合成的第一个关键酶和限速酶。已有的研究主要集中于研究不同植物中PAL催化特性以及转录水平调控,而对于酶在细胞内活性调控机制的研究则鲜有报道。研究苦荞PAL活性的调控机制,对于解析苦荞黄酮类物质代谢通路调控机制,揭示植物代谢调控动态网络有重要意义。本研究基于苦荞叶片存在高含量的次生代谢物但以经典方法无法检测到PAL活性这一现象,通过克隆苦荞FtPAL基因在实现重组表达和纯化的基础上,在体外条件下开展苦荞次生代谢物对FtPAL活性影响及苦荞PAL泛素化修饰的相关研究。主要获得如下结果:1.通过比对本地苦荞叶片转录组数据库,得到一条未经报道的苦荞PAL基因,命名为FtPAL-N。结合已报道的苦荞PAL基因(FtPAL-B),分别构建原核表达载体pET47b-PAL-N、pET47b-PAL-B及双基因共表达载体pRSF-duet1-PAL,成功实现PAL蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化。在体外条件下测定了苦荞叶片粗提液,苦荞主要次生代谢物对PAL活性影响;四聚体酶同型/异型亚基缔合对酶活性的影响。结果显示:苦荞叶片粗提液以及主要次生代谢物芦丁、槲皮素对原核表达的苦荞FtPAL活性无抑制效果;酶的同型/异型亚基缔合对FtPAL活性无明显影响。2.在添加26S蛋白酶体抑制剂MG132的苦荞叶片粗提液中可检测到PAL活性,MG132可提高子叶期幼苗粗提液中PAL的活性,结合使用Anti-FtPAL和Anti-Ub的免疫印迹分析,证明了苦荞叶片中PAL存在高度泛素化修饰,叶片中的PAL受到泛素-蛋白酶体途径专一性降解调控。以上酶活性分析及Western Blotting结果提示,现有的经典PAL活性测定方法有待修正。3.通过构建诱饵载体pGBKT7-FtPAL,酵母双杂交筛选获得一条编码泛素连接酶(E3)基因(FtPUB26)。进一步构建FtPUB26猎物载体pGADT7-FtPUB26点对点进行酵母双杂交,结合GST Pull-down以及免疫共沉淀验证PAL与FtPUB26的互作,结果显示FtPAL与FtPUB26蛋白间存在物理相互作用。4.克隆了苦荞泛素活化酶基因(FtUBA1),泛素结合酶基因(FtUBC8)以及泛素基因(FtUb),成功构建了pMAL-C4X-FtUBA1、pTWIN-1-FtUBC8及pRSF-DUET1-FtUb原核表达载体,分别利用Amylose-Sepharose亲和柱、几丁质亲和柱以及钴离子螯合柱纯化重组蛋白并通过体外泛素化反应验证其活性。结果显示,通过原核表达及亲和层析,实现了FtUBA1、FtUBC8及FtUb蛋白的表达和纯化,以上蛋白的纯化为构建PAL的体外泛素化系统奠定了基础。