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目的:腹主动脉瘤（Abdominal aortic aneurysm,AAA）是一种退行性疾病,以腹主动脉持续性扩张,因中层结构降解、弹性纤维及胶原质崩解而导致的血管退变为特征。当腹主动脉直径超过3cm或扩张率超过50%可诊断为腹主动脉瘤,并成为老年男性（65岁以上）首要猝死原因之一1。吸烟、高血压、男性、老年及家族遗传倾向被认为是腹主动脉瘤发病的首要危险因素2。小动脉瘤（直径小于5.5cm）通常由影像学检查发现。开放手术或腔内修复术对大动脉瘤（直径大于5.5cm）效果更佳3。尽管目前医疗技术发展可提供有效手术干预,6年以上腹主动脉瘤存活率小于70%4。我们仍然缺少行之有效的策略来预测腹主动脉瘤的发展及破裂风险。腹主动脉瘤病理特征包括:血管中层及外层结构细胞外基质（extracellular matrix,ECM）降解,血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）凋亡以及炎性细胞浸润。以上过程均导致血管重塑及血管壁张力下降5。同型半胱氨酸（Homocysteine,Hcy）,作为一种含硫氨基酸,是甲硫氨酸及半胱氨酸正常生物合成过程中的中间产物。Hcy代谢紊乱导致了其在体内异常蓄积,进而产生了高同型半胱氨酸循环水平,俗称高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia,HHcy）6。通常情况,HHcy是由于代谢酶缺乏或/和营养障碍导致的甲硫氨酸（methionine,Met）或同型半胱氨酸代谢异常引起的。血浆Hcy水平超过10μmol/l即可诊断为HHcy。Hcy作为一项重要的独立危险因素,参与多种血管疾病,包括:冠脉疾病、中风和外周血管疾病7。大量临床观察研究揭示了Hcy与AAA发病之间存在关联。我们的前期研究也证实,HHcy可作为AAA发病的独立危险因素。腹主动脉瘤患者血浆同型半胱氨酸水平明显高于对照组,目前Hcy已作为笔者科室腹主动脉瘤患者入院常规检查项目8。同时,我们团队的一份荟萃分析研究也证实Hcy可预测罹患AAA风险增加。伴有高同型半胱氨酸血症的受试者面临着较高的AAA风险9。尽管AAA的组织病理学特征已得到广泛的报道,Hcy参与腹主动脉瘤发病的具体机制未得到充分的认识10。目前存在大量的针对Hcy与AAA发病关系的研究,不过这些研究多局限于临床研究水平且仅仅证实Hcy可增加罹患AAA的风险。我们仍需要进一步的研究和证据来证实Hcy是如何加重AAA的发生和进展。本研究拟通过建立甲硫氨酸诱导的HHcy大鼠AAA模型,初步验证Hcy对AAA的促进加重作用并探讨炎症反应、MMP-2激活及血管平滑肌细胞表型转化是否参与此过程,并观察自噬水平;然后通过离体培养的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）,给予Hcy处理细胞,观察自噬现象及细胞表型变化并探讨自噬在此过程中的作用;最后,通过给予AMPK抑制剂,观察Hcy诱导的VSMC自噬现象是否被抑制,以明确Hcy对VSMC诱发细胞自噬的机制。实验材料与方法:1、实验试剂和材料:猪胰弹力蛋白酶（美国Sigma-Aldrich）,甲硫氨酸（北京索莱宝科技有限公司）,同型半胱氨酸ELISA试剂盒（Cell Biolabs）,弹力纤维染色液（北京雷根生物技术有限公司）,天狼星红染液（北京雷根生物技术有限公司）,SP法免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）,DAB显色液（福州迈新生物技术开发有限公司）,FITC荧光二抗（武汉proteintech）,人主动脉血管平滑肌细胞（HA-VSMC）购自上海中国科学院细胞库,高糖型DMEM、胎牛血清、胰酶、青-链霉素（Hyclone公司）,同型半胱氨酸,Dorsomorphin（美国sigma公司）,雷帕霉素（北京索莱宝科技有限公司）,3-MA（上海selleck公司）,CCK-8试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）。抗体:Anti-a-SMA（武汉proteintech）,MMP-2,IL-6,LC-3,Beclin-1,OPN兔多克隆抗体（武汉proteintech）,Anti-AMPK（美国CST）,Anti-phospho AMPK（美国CST）。2、动物模型:280-300g雄性SD大鼠40只,弹力蛋白酶灌注建立AAA模型,保持张力持续10分钟,用10-0血管缝合线,将血管上的穿刺口缝合。40只SD大鼠随机分为四组:未处理组（untreated组,n=8）、对照组（control组,在AAA外膜涂抹200μl的30%F-127凝胶,n=8）、阴性对照组(negative control,NC组,AAA外膜涂加入50μl阴性对照siRNA#1（Ambion）的200μl凝胶,n=8)、处理组（ANRIL-siRNA组,AAA外膜涂抹溶解50μl ANRIL-siRNA的200μl凝胶,n=16）。术后分笼标记,统一饲养。通过彩超检查腹主动脉直径,计算扩张率。术后4w采集标本,取材后4%多聚甲醛固定或液氮中冻存。3、形态学检测:制作组织石蜡切片,行免疫组织化学检测人腹主动脉或AAA组织中的p14ARF、bcl-2、bax、caspase-3等的表达。制作腹主动脉壁组织冰冻切片,原位杂交染色方法检测人腹主动脉组织中ANRIL的基因表达定位及定量。免疫荧光技术技术VSMC的基因转染效率。电镜观察大鼠腹主动脉及AAA,了解VSMC表型转换情况。4、血浆Hcy检测采集外周血立即3000rpm离心10min,收集血浆并保存于-80°C至使用。使用ELISA试剂盒检测Hcy水平。使用样品稀释液倍比稀释标准品,得到1000、500、125、62.5、31.2、15.6和0pg/ml 8个标准点。样品稀释液稀释血浆样本。每孔加入标准品或待测样品100ul,空白孔加入样品稀释液100ul,37℃孵育90min。弃去孔内液体加入清洗液3次后拍干。加入稀释后的二抗稀释液,每孔100ul,室温孵育1h。加入酶结合物,每孔100ul,室温孵育30min。加入酶底物,每孔100ul,室温孵育5-15min至出现标准品颜色梯度,立即加入终止液100ul。酶标仪在450nm波长处测定吸光度。计算标准曲线,获得Hcy浓度。5、Western-blot检测ANRIL相关基因的蛋白产物的表达:人及大鼠的腹主动脉瘤组织及未成瘤组织剪碎后置于EP管中,加入适量蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂,匀浆机匀浆或超声破碎细胞。离心后提取蛋白,考马斯亮蓝法检测蛋白浓度,配制聚丙烯酰胺凝胶,电泳、转膜、封闭,加一抗、二抗,ECL发光（MF-Chemi Bis）,并计算光密度值。6、免疫荧光检测:动脉标本4%多聚甲醛固定。1%牛血清白蛋白封闭,分别滴加1:200稀释的MMP-2和LC3一抗,4℃过夜,次日滴加FITC荧光二抗,使用DAPI复染细胞核,使用抗淬灭封片剂封片于荧光显微镜下观察实验结果并采集图像。7、透射电镜检测:新鲜组织确定取材部位,迅速投入电镜固定液4℃固定2-4h。0.1M磷酸缓冲液PB（PH7.4）漂洗3次,每次15min。1%的锇酸·0.1M磷酸缓冲液PB（PH7.4）室温（20℃）固定2h。0.1M磷酸缓冲液PB（PH7.4）漂洗3次,每次15min。组织依次入梯度酒精和100%丙酮行脱水,每次15min。丙酮︰812包埋剂=1︰1 2-4h,丙酮︰812包埋剂=2︰1渗透过夜,纯812包埋剂5-8h,将纯812包埋剂倒入包埋板,将样品插入包埋板后37℃烤箱过夜。60℃烤箱聚合48h。超薄切片机切片60—80nm超薄切片。铀铅双染色（2%醋酸铀饱和水溶液,枸橼酸铅,各染色15min）,切片室温干燥过夜。透射电子显微镜下观察,采集图像分析。8、细胞培养:贴壁法培养HA-VSMC细胞,细胞传代3-4次。置于37℃,5%CO2的培养箱中,使用含10%血清的高糖DMEM培养。9、细胞迁移实验:取对数生长期细胞,接种于24孔培养板,转染96h后,当细胞融合至大约90%时,划痕后24 h,倒置显微镜下（×100）测量细胞向划痕区域迁移的细胞数量。10、统计学处理:使用IBM SPSS Statistics 21.0进行统计分析。动脉瘤直径测量值单位为mm,取小数点后1位。计量资料结果以均数±标准差（?x±s）表示,两组间的比较使用使用t检验进行统计学显着差异评估。卡方检验用于评估动脉瘤的发病率。P值<0.05被认为存在显着的统计学差异。实验结果:1、甲硫氨酸饲养诱导的轻度高同型半胱氨酸血症加重弹性蛋白酶介导的腹主动脉瘤的发生及进展:表现为主动脉瘤最大直径明显增大及动脉壁增厚;2、高同型半胱氨酸血症诱导相关蛋白表达:炎性浸润（IL-6表达升高）、MMP-2活性增强、弹性蛋白纤维崩解及胶原质沉积,平滑肌细胞表型变化（OPN表达水平增高）以及自噬现象出现（LC3及Beclin-1水平升高）。3、离体培养VSMC实验研究:Hcy促进VSMC增殖和迁移能力,及表型转化（收缩型变合成型）;自噬相关蛋白LC3及Beclin-1表达水平增高（P<0.05）,表明Hcy诱导VSMC自噬现象发生。4、AMPK参与Hcy诱导自噬过程:Hcy激活VSMC的AMPK表达水平,给予细胞AMPK抑制剂,western blot检测自噬相关蛋白LC3及Beclin-1,其表达明显降低,说明Hcy诱导的自噬现象被抑制,AMPK参与Hcy诱导自噬过程。结论:1、甲硫氨酸饲养可诱导大鼠轻度高同型半胱氨酸血症,并可加重大鼠AAA的发生和进展,导致腹主动脉最大直径扩张和血管壁增厚。Hcy可引起AAA炎性浸润、MMP-2活性增强、VSMC表型转化、弹性蛋白崩解及胶原沉积,以及自噬反应的发生;2、Hcy可诱导血管平滑肌细胞表型转换,增殖和迁移并诱导自噬现象发生;3、AMPK参与介导Hcy诱导的自噬现象的过程。