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本文选取了不同类型食线虫真菌的胞外丝氨酸蛋白酶，对它们的一级结构和三级结构进行了深入的研究。克隆了粉红螺旋聚孢霉（Clonostachys rosea）胞外丝氨酸蛋白酶PrC的编码基因，对不同来源食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶的一级结构进行了同源性比较和系统发育分析，通过同源模建得到PrC的三级结构并将其与蛋白酶K的晶体结构进行了比较。通过悬滴气相扩散法获得刀孢轮枝菌（Lecanicillium psalliotae）胞外侵染性丝氨酸蛋白酶Verl12的结晶，利用X—光晶体衍射技术解析了Verl12的晶体结构，并和淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）的胞外蛋白酶PL646以及蛋白酶K的晶体结构进行了比较，从原子水平对食线虫真菌丝氨酸蛋白酶的结构特征和催化性质进行了深入的比较。通过同源模建构建了不同来源食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶的三级结构，并与其它已知晶体结构的丝氨酸蛋白酶进行了比较，同时通过对蛋白酶Verl12和PⅡ杀线虫能力的比较，深入的探讨了食线虫真菌胞外蛋白酶的结构特征和侵染线虫能力的关系。
主要的实验结果为：
1.粉红螺旋聚孢霉胞外丝氨酸蛋白酶PrC的基因克隆和同源模建分析。通过简并引物PCR及DNA walking技术克隆得到粉红螺旋聚孢霉YMF1.00611的胞外侵染性丝氨酸蛋白酶PrC全长编码序列。克隆的PrC基因全长2568 bp，包含由三个内含子和四个外显子组成的1161 bp的开放阅读框（ORF）。PrC基因编码386个氨基酸，其中信号肽包括15个氨基酸，前肽94个氨基酸，其余的277个氨基酸为成熟肽。成熟蛋白酶的理论分子量和等电点分别为27 kDa和6.82。PrC在氨基酸序列上与其它食线虫真菌和昆虫病原真菌的侵染性丝氨酸蛋白酶具有较高的同源性，属于丝氨酸蛋白酶S8家族。
以蛋白酶K的晶体结构为模板，通过同源模建得到了PrC的三级结构。保守的丝氨酸蛋白酶的折叠模式以及催化三聚体构象表明，PrC采取经典的丝氨酸蛋白酶催化机制降解蛋白底物。
2.刀孢轮枝菌蛋白酶Ver112的纯化、结晶、结构解析和催化特性研究通过盐析，分子筛和阳离子交换层析从刀孢轮枝菌发酵液中纯化得到蛋白酶Ver112，并通过悬滴气相扩散法得到Ver112的晶体。
通过X—射线晶体衍射得到衍射数据，最高分辨率为1.6A。使用分子置换法解得相位，通过结构修正，加水得到蛋白酶Ver112的晶体结构。蛋白酶Ver112的结构包含六个α螺旋，一个九股平行β折叠片和两个两股反平行折叠片蛋白酶含有5个半胱氨酸，其中四个组成两个二硫键。蛋白酶Ver112含有一个钙结合位点。
对蛋白酶Ver112、淡紫拟青霉丝氨酸蛋白酶PL646和及蛋白酶K的一级和三级结构进行比较。两个食线虫真菌胞外蛋白酶Ver112和PL646的晶体结构比较相似，且与蛋白酶K的结构也较为相似。PL646—Ver112、PL646—3PRK和Ver112-3PRK的CαRMSD值分别为0.57A、0.69A和0.70A。其不同之处主要在于底物结合口袋S1和S4处存在一定的氨基酸残基的变化，导致三个蛋白酶底物结合口袋尺寸和亲疏水性的变化，进而导致对多肽底物残基P1和P4结合偏好性的变化。进一步设计了具有不同P1和P4残基的多个四肽底物，通过酶学性质测定、比较以上三个酶对这些四肽底物的催化动力学（Kinetics）参数Km和Kcat，验证了基于结构的底物特异性推测。此外，蛋白酶Ver112和PL646的分子表面除底物结合区外具有较强的亲水性，并且在中性条件下带有较强的正电荷，这一分子表面特征对真菌侵染活性可能具有重要影响。
3.食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶的结构比较及其与杀线虫活性相关的结构基础研究
通过对蛋白酶氨基酸序列分析，发现食线虫真菌蛋白酶的系统发育树主要分成两支：碱性丝氨酸蛋白酶和中性丝氨酸蛋白酶。碱性蛋白酶来源于线虫内寄生真菌，而中性蛋白酶来源于捕食线虫真菌。
从刀孢轮枝菌和寡孢节丛孢（Arthrobotrys oligospora）的发酵液上清中分别纯化得到碱性和中性丝氨酸蛋白酶的代表性酶Ver112和PⅡ，并对两者的热稳定性和杀线虫活性做了比较，发现Ver112比PⅡ具有更高的热稳定性和杀线虫活性。
通过同源模建得到了14个中性蛋白酶的三级结构，并与4个碱性蛋白酶的结构进行了比较。发现它们整体折叠方式相似，但碱性蛋白酶在二硫键位置和分子表面的静电特征上与中性蛋白酶有所不同。
通过动力学模拟研究，发现碱性蛋白酶的二硫键不但具有提高分子热稳定性的作用，而且能够提高催化活性中心的构向柔性，从而提高催化效率。
通过系统发育分析，发现食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶的分子表面电势和分子系统发育关系相关，且自中性至碱性逐渐变化。由于线虫体壁带有大量负电荷，因此碱性蛋白酶的正电表面有利于对线虫体壁的吸附和降解，是适应性进化的一种表现。对于来源于捕食线虫真菌的中性蛋白酶，可以通过蛋白质工程的手段改造以提高其杀线虫的活性和能力。
论文的创新性主要表现为：
1）报道粉红螺旋聚孢霉的胞外丝氨酸蛋白酶PrC的编码基因，为进一步研究该菌株的侵染机制奠定基础。
2）报道刀孢轮枝菌胞外侵染性丝氨酸蛋白酶Ver112的X—射线晶体结构，对蛋白酶Ver112和PL646的分子结构和底物结合位点与蛋白酶K进行了比较，首次在原子水平上对食线虫真菌侵染性丝氨酸蛋白酶的催化机制和催化特征进行了深入的比较和探讨。
3）系统描述和比较了不同食线虫真菌来源胞外侵染性丝氨酸蛋白酶的三级结构，首次提出蛋白酶的表面电势和二硫键是影响不同蛋白酶水解线虫体壁活性的重要结构基础。