猪瘟病毒RT-LAMP检测方法的建立及其对树突状细胞免疫学特性影响的研究

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猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,对养猪业危害较为严重。在我国,猪瘟流行呈现典型和非典型共存、持续感染与隐性感染共存、免疫耐受和带毒综合征共存等现象。CSFV只有通过实验室检测才能确诊。树突状细胞(Dendritic cell,DC)是体内功能最强大的专职抗原递呈细胞,是机体免疫反应的始动者,在特异性免疫中起着十分重要的作用,与病原微生物感染发病和机体免疫预防都有着十分紧密的联系。 本研究对GenBank中注册的CSFV序列进行比对分析,根据CSFV部分Npro/C基因中的保守区域设计合成了1对引物,对CSFVT株(Thriverval株)进行RT-PCR扩增,所扩增片段大小为488bp。将获得的RT-PCR产物进行序列测定,对测得的核苷酸序列进行分析。结果表明,该株的部分Npro/C基因核苷酸序列与Alfort株的相似性为99.5%,与CSFV石门株的相似性为97.4%。本研究根据CSFV的Npro/C基因区域设计了一套反转录—环介导等温扩增(Reverse transcriptase loop—mediated isothermal amplification,RT—LAMP)引物,在成功扩增出特异片段的基础上,优化RT—LAMP反应体系和条件,经特异性、敏感性及重复性试验,成功建立了CSFV的RT—LAMP快速检测方法。 本研究通过分离猪外周静脉血,用贴壁法获取单核细胞,体外联合应用重组猪源GM—CSF和IL—4诱导培养DC。用CSFV感染DC,流式细胞术检测显示:感染活CSFV、灭活CSFV作用后和LPS刺激的成熟DC与正常DC均低表达SLA—Ⅱ—DR,感染活CSFV和灭活CSFV作用后的未成熟DC几乎不表达;感染活CSFV、灭活CSFV作用后的和正常的未成熟DC均高表达表面分子CD1,感染活CSFV、灭活CSFV作用后和LPS刺激的成熟DC均中度表达CD1,灭活CSFV作用的DC CD1表达率与对照组的差异显著;感染活CSFV的成熟DC高度表达表面分子CD172a,其余均中度表达。用Real-Time FQ-PCR方法检测CSFV对未成熟DC表面分子和细胞因子CD80、CD83、CD86和IL-10 mRNA水平的影响。结果显示,只有感染活CSFV后DC CD86mRNA水平与正常DC相比有显著性上升(P<0.05),而灭活CSFV作用后的DC CD86mRNA水平则与正常DC无差异(P>0.05);感染活CSFV和灭活CSFV作用后的DC与正常DC的CD80、CD83和IL-10 mRNA水平均无差异(P>0.05)。
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