【摘 要】
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目的：利用bac-to-bac杆状病毒表达系统对人的Cytochrome P450 Reductase(CPR)的基因得以表达,得到CPR的真核表达产物,为CPR的功能研究以及药物体外代谢奠定基础。 方法：设计
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目的：利用bac-to-bac杆状病毒表达系统对人的Cytochrome P450 Reductase(CPR)的基因得以表达,得到CPR的真核表达产物,为CPR的功能研究以及药物体外代谢奠定基础。
方法：设计引物,扩增得到Cytochrome P450 Reductase(CPR)的开放阅读框(ORF),将其克隆到供体质粒pFastBacTM1中,经PCR、酶切和测序鉴定后,将测序正确的质粒转化DH10Bac菌,经筛选、鉴定后,抽提并获取高纯度的重组穿梭载体Bacmid-cpr。用脂质体介导法将重组穿梭载体Bacmid-cpr转染Sf9昆虫细胞,获得重组病毒,并反复扩增后得到大量表达CPR蛋白的重组杆状病毒。用重组的杆状病毒再次感染Sf9昆虫细胞得到Cytochrome P450 Reductase(CPR)蛋白,并对蛋白进行Western-blot鉴定。
结果：1.构建了携带cpr基因片段的重组供体质粒pFastBac 1-cpr,经PCR鉴定,双酶切鉴定和序列分析证实cpr基因已正确插入供体质粒的多克隆位点；2.构建了携带cpr基因片段的重组穿梭载体Bacmid-cpr,经PCR鉴定分析证实cpr基因已正确转座插入穿梭载体的转座位点；3.用bac-to-bac杆状病毒表达系统表达了CPR蛋白,并经Western-blot分析鉴定,分子量约为78kD,与理论分子量相符。
结论：本研究成功地在杆状病毒-昆虫表达系统中表达了CPR蛋白,为CPR蛋白的进一步的功能研究和实际应用奠定了良好的基础。
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