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Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)是一种跨膜受体蛋白,由胞外区、跨膜区和胞内区构成,主要表达在单核/巨噬细胞、树突状细胞和上皮细胞上。TLRs可识别外源抗原,通过MyD88依赖和MyD88非依赖的信号途径,激发机体产生天然免疫应答。另外,通过将信号传递给T淋巴细胞和B淋巴细胞,诱导机体获得性免疫应答的产生。研究表明,TLRs的突变或是缺失可使机体抵抗细菌感染能力减弱,从而导致不同物种产奶、产蛋率甚至生存率下降。Toll样受体5(TLR5)可识别细菌特别是沙门氏菌、空肠弯曲菌等人兽共患病原菌的鞭毛蛋白。本研究制备了稳定表达猪TLR5的细胞系,为制备猪TLR5单抗提供了生物学材料.同时亦为深入研究上述病原菌对家畜的致病机理奠定基础。1.猪TLR5基因的克隆与表达从姜曲海猪全血中提取基因组,利用PCR方法扩增出TLR5基因,克隆到pCR2.1载体,构建重组质粒pCR2.1-TLR5。重组质粒经EcoR V和Sal1双酶切,连接到pET载体,构建重组质粒pET-TLR5。重组质粒pET-TLR5转化大肠杆菌BL21(DE3),并诱导表达TLR5蛋白。Western blotting分析表明,表达的TLR5蛋白在大小95.2KD左右,且与兔抗鼠TLR5单抗发生特异性结合,说明原核表达的TLR5蛋白具有良好的免疫反应性。将TLR5蛋白免疫小鼠,制备获得抗TLR5多抗血清,效价为1：25600。重新设计一对引物,应用PCR方法扩增C端去除终止子的TLR5基因片段,连接到pCR2.1载体,构建重组质粒pCR2.1-TLR5。重组质粒经Nhe I和Yha I双酶切,连接到真核表达载体pcDNA3.1-FLAG,构建重组质粒pcDNA3.1-TLR5-FL AG,经Nhe I和4pa I双酶切重组质粒,获得TLR5-FLAG片段,连接到真核表达质粒pcDNA5/FRT,获得重组质粒pcDNA5/FRT-TLR5-FLAG。将重组质粒pcDNA3.1-TLR5-FLAG、pcDNA3.1-FLAG分别瞬时转染COS-1细胞,转染48h后应用间接免疫荧光检测目的蛋白表达情况。结果显示,pcDNA3.1-TLR5-FLAG转染细胞出现荧光,表明TLR5基因在COS-1细胞系中获得表达,并且蛋白分布于细胞膜上2.稳定表达猪TLR5分子细胞系的建立及初步应用将重组质粒pcDNA5/FRT-TLR5-FLAG与重组酶表达质粒pOG44以1：9质量比,共转染Flp-In-293细胞。48h后更换完全培养基1：3扩大培养,待细胞汇合度达70%-80%时,使用含120μg/ml Hygromycin B完全培养基进行抗性筛选。胰酶消化挑取单克隆进行扩大培养,应用FACS鉴定重组细胞系。结果显示,重组细胞系成功表达TLR5蛋白。经进一步亚克隆筛选,获得单克隆细胞系,命名为pTLR5-Flp-In-293(3-3).β-半乳糖苷酶活性及Zeocin抗性检测结果显示,pTLR5-Flp-In-293(3-3)细胞系丧失β-半乳糖苷酶活性和Zeocin抗性,且获得Hygromycin B抗性。RT-PCR检测细胞系TLR5基因的转录,结果显示,从细胞系中扩增出了TLR5片段,说明TLR5基因在细胞系中获得转录。间接免疫荧光结果表明,pTLR5-Flp-In-293(3-3)细胞系成功表达TLR5蛋白,且表达在细胞膜上。Western blotting分析结果显示,在95.2KD处有目的条带,且TLR5蛋白与FLAG蛋白融合表达,阴性对照无任何条带。将第1、10、20代细胞作FACS分析,与阴性对照Flp-In-293细胞相比,重组pTLR5-Flp-In-293(3-3)细胞系第1、10、20代均能表达相同水平的TLR5蛋白,说明构建的细胞系具有良好的稳定性。应用不同浓度的鞭毛蛋白刺激细胞系,ELISA定量检测IL-8分泌情况。结果显示,pTLR5-Flp-In-293细胞系可分泌较高水平的IL-8,说明重组pTLR5-Flp-In-293(3-3)细胞系表达的TLR5蛋白可与鞭毛蛋白相互作用。