敌敌畏胁迫下深绿木霉(Trichoderma atroviride)ABC转运蛋白表达与功能分析

• 作 者: 张泰龙
• 机 构: 上海交通大学
• 出 处: 上海交通大学
• 发表日期: 2015年期
• 关键词: 深绿木霉 敌敌畏 ABC转运蛋白 生物降解 农药残留

木霉菌对有机磷农药的耐受性是其生物降解农药残留的重要前提，因此，研究ABC转运蛋白在木霉菌耐受敌敌畏中的作用具有重要意义。　　利用RNA-seq转录组分析对深绿木霉T23中敌敌畏耐受相关基因进行挖掘，共得到5382个差异表达基因，从中鉴定出137个hex1调控下的敌敌畏胁迫应答基因，其中25个基因参与转运过程。KEGG代谢通路分析表明ABC转运蛋白在敌敌畏耐受中起到重要作用。通过保守区域BLAST，在深绿木霉基因组中检索到31个耐药相关ABC转运蛋白基因，根据转录组分析结果与基因功能注释从中筛选7个进行表达分析。　　采用荧光定量方法分析了加入敌敌畏胁迫0h、2h、6h和24h后，深绿木霉中7个候选ABC转运蛋白基因的表达变化，发现PDR、MRP、MDR三个亚家族中各自具有类似的表达变化趋势，其中一个PDR型基因在6 h的表达量上调3000倍以上，命名为TaPdr2；同样地，分析了深绿木霉T23、?hex1以及hex1回补株中，ABC转运蛋白基因的表达差异，发现hex1敲除后的ABC转运蛋白表达显著上调，而敌敌畏胁迫加入后，表达量显著降低。　　采用兼并引物同源克隆在深绿木霉T23基因组中扩增得到TaPdr2与TaMrp1基因并测序其全长序列，分析了TaPdr2与TaMrp1的系统发生树并对其蛋白结构进行了预测。TaPdr2转录本具有315bp的3’端UTR序列，与PDR5以及CDR转运蛋白亚家族有很高同源性，TaPDR2与TaMRP1蛋白都位于细胞膜。　　采用ATMT介导的同源重组基因敲除，成功获得插入位置正确的TaPdr2敲除子。通过分析敲除子与野生型的表型差异，发现敲除TaPdr2基因后，深绿木霉敌敌畏耐受能力显著降低，敌敌畏胁迫下菌丝麦角甾醇含量降低约50％，电解质外渗变化不显著。