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盐地碱蓬是一种叶肉质化的稀盐盐生植物。盐地碱蓬在滨海的潮间带或者部分涝洼积水地带在整个生长期植株地上部分皆为紫红色,而在地势较高或者距离海边较远的地方植株则呈现绿色。作为一种真盐生植物,盐地碱蓬的耐盐机理已得到了比较广泛的研究。且已证明盐地碱蓬中的红色素为甜菜红素。但是,盐地碱蓬中甜菜红素积累的生物学意义至今尚未见报道。目前甜菜素合成的分子机理和相关基因的表达调控也不明晰。甜菜素合成途径相关酶的功能定位、特性分析、基因克隆以及相关基因表达调控的研究也是需要深入的领域。本实验克隆了合成甜菜红素的关键酶之一——4,5-多巴双加氧酶的基因和启动子,研究其表达特点,为进一步研究甜菜红素在盐生植物进化和生态适应等方面的作用机理奠定了基础。研究结果如下:1.盐地碱蓬DODA基因克隆及序列分析根据GeneBank中已知的DODA基因的cDNA和蛋白序列寻找保守区以合成简并引物,以盐地碱蓬总RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得500 bp的保守片段;BLAST分析表明该片段与其它植物DODA同源性较高,初步确定为盐地碱蓬DODA基因序列;根据该序列设计用于3’-RACE和5’-RACE的基因特异性引物,分别扩增得到350 bp的3’-末端和250 bp的5’-末端;将三段序列进行拼接,获得盐地碱蓬基因DODA的全长,进而设计引物扩增获得其全长。SsDODA cDNA序列全长1030 bp,包括71 bp的5’-非编码区和146 bp的3’-非编码区。开放阅读框为813 bp,编码271个氨基酸残基,分子量约30.4kDa。BLAST分析表明盐地碱蓬4,5-多巴双加氧酶与来源于其他物种的4,5-多巴双加氧酶具有较高的序列相似性,与Beta vulgaris在氨基酸水平上具有80%的序列一致性。2.植物表达载体pROKII::SsDODA的构建经Xba I和BamH I酶切的pMD18-T::SsDODA和pROKII载体通过T4 DNA连接酶连接,连接产物转经PCR以及酶切鉴定确定为重组质粒,且外源片段方向正确,命名为pROKII::SsDODA。3.转基因拟南芥的筛选pROKII::SsDODA转化农杆菌GV3101,阳性克隆侵染拟南芥。在50 mg/L卡那霉素的筛选压下,获得约100株抗性苗。转化株自交以获得纯合的转基因株系。4. SsDODA启动子的分离和功能预测使用TAIL-PCR法首次成功地从盐地碱蓬基因组中克隆了4,5-多巴双加氧酶基因SsDODA的启动子片段。使用PLACE数据库对500 bp的SsDODA启动子片段进行顺式作用元件分析,结果表明启动子序列中除了TATA-motif、CAAT-motif等典型的真核生物顺式调控元件外,还含有其他重要的顺式调控元件如光反应元件:-10PEHVPSBD,I box;低温响应元件LTR;脱水应答元件MYCCONSENSUSAT等。5.植物表达载体pBI121::SsDODA-P的构建Hind III和BamH I双酶切pBI121质粒,去掉约0.8 kb的35S启动子片段,回收大片段,并与同样经HindⅢ和BamH I双酶切的SsDODA启动子片段连接,构建成与报告基因GUS融合的植物表达载体pBI121::SsDODA-P。6. SsDODA启动子的GUS活性检测将植物表达载体pBI121::SsDODA-P转入根癌农杆菌EHA105,阳性克隆转化烟草,GUS组织化学检测结果表明,盐地碱蓬SsDODA启动子片段能够驱动报告基因GUS在烟草叶片中表达,证明克隆得到的SsDODA启动子片段具有启动子活性。