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香蕉(Musa AAA)果实“青皮熟”现象是一种特殊的生理失调现象,即果肉变软,果皮不能正常褪绿的现象。探讨采后香蕉果实在25℃以上出现“青皮熟”的机理具有一定的理论和生产应用价值。我们以往的研究发现,“青皮熟”的香蕉果皮在后熟过程中迅速积累葡萄糖和果糖,果皮叶绿素降解受抑制,不能正常褪绿。为了探讨高含量的葡萄糖对果皮褪绿的影响,本研究利用添加或不添加葡萄糖的琼脂培养基,在20℃黑暗条件下进行香蕉果皮的离体培养,分析糖信号Marker基因在离体糖培养和“青皮熟”形成过程中的表达,探讨糖信号在香蕉果实“青皮熟”形成中的可能作用。另外,为进一步研究“青皮熟”形成机理提供依据,通过抑制性消减杂交(SSH),进行20℃和30℃下后熟早期的香蕉果皮特异表达基因的筛选。
离体培养结果表明,培养基中添加150 mM葡萄糖抑制了离体香蕉果皮的褪绿,延缓了果皮叶绿素含量和叶绿素荧光Fv/Fm的下降,延缓了果皮膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)的积累,由此可知,糖培养延缓了离体果皮的褪绿,也在一定程度上延缓了离体果皮的膜脂过氧化作用。
为了进一步研究葡萄糖延缓离体香蕉果皮的褪绿衰老的机理,本研究分析了糖培养对叶绿素降解和后熟相关基因表达的影响。Northern杂交结果表明,在培养的前期,糖处理促进了叶绿素降解相关基因NYC、P(α)O和SGR基因的表达,5天后轻微抑制这些基因的表达。糖处理在2-5天促进了乙烯合成相关基因ACO和ACS基因的表达,在后期促进衰老相关基因SAG的表达。这些结果表明,糖处理可能是在后期通过抑制叶绿素降解相关基因的表达来抑制果皮叶绿素降解,而糖处理并没有抑制后熟和衰老相关基因的表达,推测果皮褪绿的延缓可能不是由于后熟进程的推迟导致的。
对部分糖信号相关基因PLD、PR1、CIN1、H-ATPase以及PAL的表达分析发现,不论整蕉还是离体果皮中糖信号相关基因PLD、PR1、CIN1、H-ATP均有表达,未能检测PAL基因的表达。在整蕉中,仅PR1基因在后熟前期30℃下后熟的果皮表达量比20℃高,30℃并没有诱导其他糖信号基因的表达。而在果皮的离体培养中,发现糖处理促进.PR1和CIN1的表达,对其他糖信号基因影响不大。这些结果表明,离体培养的糖处理可能启动了某些糖信号途径,而在整蕉,30℃条件下的后熟导致的糖的积累却可能未启动已报道的糖信号途径。
利用SSH技术,本研究分别建立了20℃比30℃表达上调的20℃cDNA文库和30℃比20℃表达上调的30℃cDNA文库,生物信息学软件分析可知,在20℃cDNA文库中获得46个特异基因(unigene),这些基因主要参与了呼吸作用、蛋白降解、后熟、信号转导和逆境相关等途径,其中,后熟及抗逆途径在整个过程中所占有的比例较高,分别为20％和24.45％。在30℃cDNA文库中仅获得13个特异基因,与呼吸作用、蛋白降解、逆境等途径相关,其中,有30.77％与呼吸作用相关。经半定量PCR的方法验,从20℃cDNA文库中挑选出来的谷胱甘肽硫转移酶(GST)、质体末端氧化酶(PTO)、硫氧还蛋白(ThioR)基因在20℃下表达较强;而从30℃cDNA文库中挑选出来的甲酸脱氢酶(FDH)、乙醇脱氢酶(ADH)、果糖.二磷酸醛缩酶(FBA)基因的表达水平在30℃下比20℃下稍高。
综上所述,糖信号相关基因表达分析表明30℃下后熟导致的“青皮熟”的现象未启动己报道的糖信号途径,葡萄糖培养抑制离体果皮的褪绿,在一定程度上类似“青皮熟”现象,可能启动某些糖信号途径。转录组学的初步研究表明,“青皮熟”的现象可能与呼吸作用和逆境相关,值得进一步研究。