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研究背景和目的急性肺损伤(Acute Lung Injury, ALI)/急性呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome, ARDS)指由心源性以外的各种肺内外致病因素导致的肺部炎性反应,使肺泡-毛细血管上皮细胞及肺部屏障结构受损,肺气体交换功能发生障碍,是一种以急性、进行性、顽固性低氧血症为特征的临床综合征,是目前导致危重病人死亡的主要原因。尽管不断出现新的治疗ALI/ARDS的方法,包括肺保护性通气策略、体外膜肺氧合、高容量血液滤过等,但其死亡率依然高达30%-50%。在ALI/ARDS发生发展过程中,肺泡巨噬细胞介导的固有免疫反应发挥着关键作用。当肺组织受到肺内外各种因素刺激时,可以活化肺泡巨噬细胞膜上的Toll受体(Toll-like receptors, TLRs),再经信号蛋白的转导活化核转录因子-KappaB (nuclear factor-KappaB, NF-κB),诱导大量炎症因子的表达释放,促使炎症反应的级联放大,形成肺内炎症“瀑布”反应,导致ALI/ARDS的发生。因此,抑制肺泡巨噬细胞过度活化、降低肺内炎症反应是治疗ALI/ARDS的根本措施。microRNA-146a (miR-146a)在固有免疫反应的调控中具有重要作用,它通过靶向沉默TLRs/NF-κB信号通路中的两个关键信号转导蛋白,能够阻断NF-κB活化,从而抑制炎症因子的释放,有望成为抑制肺泡巨噬细胞过度活化,降低肺内炎症反应的有效措施。本实验首先通过体外构建肺泡巨噬细胞炎症反应模型,观察miR-146a和炎症因子的表达变化,分析miR-146a在肺泡巨噬细胞炎症反应中的调控作用,然后经体外转染miR-146a mimic上调肺泡巨噬细胞内miR-146a的表达,观察miR-146a对炎症因子和炎症信号通路关键蛋白表达的影响,分析它在肺泡巨噬细胞炎症反应中的调控机制,最后于体内构建大鼠ALI模型,观察miR-146a在肺损伤组织中的表达变化,并结合体外研究结果,探讨其在大鼠ALI模型中的调控作用及作用机制,为临床治疗ALI提供新的治疗思路。研究内容和方法：1体外实验(1)将体外培养的大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)按2×106个/孔接种于六孔板,细胞贴壁90min,加入终浓度1μg/ml LPS处理细胞,于刺激0h、3h、6h、12h的各个时间点收集细胞和细胞上清液。用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)分别检测细胞中TNF-α mRNA和miR-146a的表达变化,用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养上清液中TNF-α蛋白的表达变化；(2)将体外培养的NR8383细胞按1.5×106个/孔接种于六孔板,细胞贴壁90min,加入50nM浓度的miR-146a mimic转染NR8383细胞24h后收集细胞。用RT-qPCR检测细胞中miR-146a上调的表达倍数和miR-146a两个靶基因IRAK-1mRNA和TRAF-6mRNA的表达变化,用Western blot检测细胞内IRAK-1和TRAF-6的表达变化,验证miR-146a转染的有效性以及验证miR-146a的靶基因；(3)将体外培养的NR8383细胞按1.5×106个/孔接种于六孔板,细胞贴壁90min,加入50nM浓度的miR-146a mimic转染NR8383细胞24h,再加入终浓度1μg/ml LPS处理细胞6h后收集细胞和细胞上清液。用RT-qPCR检测细胞中TNF-a mRNA和miR-146a的表达变化,用ELISA检测细胞培养上清液中TNF-a蛋白的表达变化,用免疫荧光及Western blot检测细胞内NF-κB p65的核移位变化,明确miR-146a对炎症反应的调控作用及作用机制。2体内实验选择雄性SPF级8～10周龄SD大鼠,按7.5mg/kg的脂多糖,经气道滴入大鼠肺部诱导ALI模型,造模6小时后处死大鼠,检测肺损伤程度。留取右肺行肺泡灌洗,用ELISA检测灌洗液中TNF-a蛋白的表达变化；留取左肺用RT-qPCR检测肺组织中miR-146a以及TNF-a mRNA的表达变化、用Western blot检测NF-κB p65含量变化。结果：1.体外实验结果(1)LPS刺激NR8383细胞后,诱导了细胞内炎症因子TNF-α的表达变化,其中3、6、12h时间点的TNF-α mRNA表达量分别是0h对照组的67.48±24.52倍(P<0.01)、29.53±4.26倍(P<0.01)、11.37±2.52倍(P<0.01)；细胞上清液中TNF-α蛋白的含量于LPS刺激Oh后逐渐上升,0h为29.53±7.80pg/ml、3h为359.80±57.54pg/ml (P<0.01)、6h为586.22±30.57pg/ml (P<0.01)、12h为729.22±50.40pg/ml (P<0.01)。(2)LPS刺激NR8383细胞后,诱导了细胞内炎症因子TNF-α的表达变化,同时也诱导了miR-146a的表达变化,3h与0h miR-146a表达量差异无统计学意义、6h和12h miR-146a的表达量逐渐升高,分别是0h的5.33±0.81倍(P<0.01)和8.21±1.19倍(P<0.01)。(3)转染50nM浓度的miR-146a mimic入NR8383细胞24h后,与control相比较,miR-146a的表达量上调至24.55±6.14倍(P<0.01),miR-146a的靶基因IRAK-1mRNA和TRAF-6mRNA表达量无明显变化,而IRAK-1和TRAF-6蛋白表达水平分别下降至0.73±0.05倍(P<0.05)和0.64±0.09倍(P<0.05)。(4)转染50nM浓度的miR-146a mimic入NR8383细胞24h后,给予LPS刺激6h后,相对control组,转染miR-146a mimic组TNF-α mRNA表达下降至0.47±0.06倍(P<0.05),细胞上清液中TNF-α蛋白从616.6±42.28pg/ml下降至211.5±30.39pg/ml (P<0.01),细胞浆中NF-κB p65蛋白含量增加至1.74±0.11倍(P<0.05),细胞核中NF-κB p65蛋白含量下降至0.56±0.12倍(P<0.05),NF-κBp65核移位明显受到抑制。2.体内实验结果：LPS气管滴入大鼠肺部6h后,ALI模型构建成功：氧和指数<300mmHg、肺病理损伤严重、模型组肺泡灌洗液中TNF-α蛋白为506.4±40.3pg/ml,明显高于对照组48.51±12.11pg/ml(P<0.01);相对于对照组,模型组肺组织细胞浆中NF-κB p65蛋白含量下降至0.37±0.14倍(P<0.05),细胞核中NF-κB p65蛋白含量增加至2.43±0.12倍(P<0.05)、TNF-a mRNA表达上调了3.61±1.03倍(P<0.05),miR-146a的表达上升2.07±0.26倍(P<0.05)。结论：在LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应中,miR-146a通过靶向作用于TLRs/NF-κB信号通路中的两个关键信号转导蛋白IRAK-1和TRAF-6,从而阻断NF-κB的活化,抑制炎症因子TNF-a的释放；在LPS诱导的ALI模型中,LPS同样诱导了miR-146a的表达上调。因此,可以推测,在ALI发生过程中,通过上调肺泡巨噬细胞内miR-146a的表达,可以阻断肺泡巨噬细胞内TLRs/NF-κB信号通路的活化,从而减少肺部炎症因子的释放,减轻肺部炎症反应,有望提高ALI/ARDS成功救治率。