论文部分内容阅读
前言
曲古抑菌素A(Trichostatin A，TSA)是属于羟肟酸类的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)。作为一种链霉菌的代谢产物，TSA是第一个被发现的天然产物。许多研究表明，TSA可特异性抑制组蛋白去乙酰基酶而调控相关基因表达，进而抑制癌细胞的体内外生长、逆转肿瘤细胞表型、诱导凋亡和增强细胞分化。由此可见，TSA是一种具有较好应用前景的抗肿瘤药物，其作用的分子机制日益引起人们的关注。
S100A4是S100蛋白家族成员之一，该基因定位于1q21，编码蛋白由101个氨基酸组成，分子量为11.5KD。临床病理学研究表明其高表达与胃癌、肺癌等多种肿瘤的浸润、转移及不良预后密切相关。细胞生物学和动物实验表明，RNAi抑制S100A4表达后，可抑制胃癌、胰腺癌、骨肉瘤等细胞的体内外增殖，并诱导细胞凋亡，证明该基因可能在胃癌等肿瘤的发生进展中发挥重要作用。本课题组前期研究发现，TSA可抑制S100A4第一内含子中转录调控区域的活性，其中对S100A4基因的+550到+710区域抑制作用最明显，进而使胃癌细胞BGC823中S100A4表达明显降低，而且S100A4介导TSA对胃癌细胞增殖、凋亡和迁移力等多种特性的影响，即S100A4是TSA发挥作用的重要靶分子。但是TSA对AGS、MGC803等其它胃癌细胞中S100A4表达是否也有相同的影响，有待进一步研究。TSA如何下调S100A4表达？其作用机制目前尚不清楚。
鉴于TSA对S100A4基因的+550到+710区域抑制作用最明显，本文将该区域命名为S100A4基因调控区。我们采用生物信息学预测发现，在人类S100A4基因的该区域存在转录因子Sp1结合位点。Sp1是Sp/XKLF(Specificity protein/Kru¨ppel-like factor)家族中第一个被鉴定的成员，它可特异性地识别富含GC的元件而参与多种基因的转录调控，是目前研究得比较深入的转录因子之一。已有研究发现TSA可通过Sp1介导而调控相关基因表达，因此我们推测TSA对S100A4拘影响可能与转录因子Sp1有关，并对此展开研究。该研究将为认识TSA在胃癌细胞中发挥作用的分子机制提供重要线索
材料与方法
一、实验材料
1、人胃癌细胞系BGC823、AGS和MGC803。
2、Real-time RT-PCR及Western blot印迹杂交相关试剂。
3、染色质免疫沉淀(ChIP)相关试剂。
二、实验方法
1、胃癌细胞培养及处理
1)常规培养胃癌细胞BGC823、AGS和MGC803
2) TSA处理:BGC823、AGS和MGC803细胞
3) MTM和/或TSA处理:BGC823细胞
2、Real-time RT-PCR检测胃癌细胞BGC823、AGS和MGC803中S100A4和Sp1 mRNA表达。
3、Western blot检测胃癌细胞BGC823中S100A4蛋白表达。
4、ChIP实验在体内条件下验证Sp1与S100A4调控区结合。
结果
1、TSA处理胃癌细胞BGC823后，S100A4 mRNA和蛋白表达明显降低，与前期报道一致。
2、TSA处理AGS、MGC803等其它胃癌细胞后，S100A4 mRNA表达水平显著降低。
3、ChIP结果证明，转录因子Sp1能与S100A4基因调控区结合。
4、Real-time RT-PCR和Western blot检测结果显示，Sp1抑制剂MTM能够回复TSA对S100A4表达的抑制。
5、TSA处理胃癌细胞AGS、MGC803和BGC823后，Sp1 mRNA表达水平显著升高。
结论：
1、除胃癌细胞BGC823外，TSA还能下调AGS、MGC803等其它胃癌细胞中S100A4 mRNA表达。
2、转录因子Sp1可与S100A4基因调控区结合。且Sp1抑制剂MTM能回复TSA对S100A4表达的抑制。
3、TSA处理使胃癌细胞BGC823、AGS和MGC803中Sp1 mRNA表达上调。