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目的:本实验研究通过建立心肌梗死后心衰大鼠模型,观察中药益气活血复方对心肌梗死后心衰大鼠心室重塑及其相关因子的影响,即心肌中基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、基质金属蛋白酶抑制剂-3(TIMP-3)、骨桥蛋白(OPN)、转化生长因子β1(TGF-β1)及结缔组织生长因子(CTGF)的表达影响。从组织形态学、蛋白及基因等方面研究其作用机制及作用靶点,为中医药防治心衰开拓新思路、提供新策略。材料与方法:1.选用体重为230～260克,SPF级12周龄雄性健康SD大鼠100只。随机选取10只,不予任何处理,做为空白对照组。余90只大鼠经适应性喂养1周,予10%水合氯醛0.3～0.4ml/100g腹腔注射麻醉,背位固定,用LED压舌板伸入舌根部下压,可见一张一合呈呼吸节律的声门,待声门张开时予12号大鼠灌胃针头插入气道,连接小动物呼吸机进行人工呼吸(频率为70次/min,潮气量为6～8ml,呼吸时间比为1:1)。经胸部备皮后,将针形电极刺入大鼠四肢及胸壁皮下,连接小动物心电图机,记录心电图。于左侧第4肋间开胸,钝性分离胸部肌肉,暴露肋骨,钝性分离肋骨间肌肉组织,拨开胸腺,撕开心包膜,于左冠状动脉前降支起点2mm处用6号线结扎冠状动脉前降支。心脏表面给予利多卡因注射液0.1ml以预防室性心律失常的发生,重置心脏于胸腔,分层缝合胸壁。记录术后心电图。术后心电图表现为ST段明显抬高即判定为发生心肌梗死。术后连续注射青霉素钠4万U/只,持续3d,以预防感染。常规喂养1周后将饲料减半,同时每日游泳至其力竭(把大鼠置于长1.5m、宽1.0m的水池中,水深约0.5m,水温32～34℃;以大鼠头部完全沉入水中,肢体无明显摆动,判断为力竭),1次/d,共4周。行超声心动图检测大鼠射血分数(EF),计算心脏指数(CI);以EF≤45%或CI≤180ml·min-1·kg-1作为心力衰竭成功造模的标准。对90只大鼠造模过程中,因麻醉死亡3只,术中死亡10只,术后死亡17只,力竭式游泳过程中及游泳后死亡8只。2.将造模成功的大鼠按照随机数字表法分为模型组18只、益气活血复方组17只、赖诺普利组17只(最后取材时按每组各10只标准处置)。空白对照组和模型组大鼠予蒸馏水灌胃,3m L/次,1次/日。各给药组大鼠按人鼠剂量公式换算给药剂量。赖诺普利组1.5mg生药/Kg/d;益气活血复方组9.2g生药/Kg/d。两组药均溶于3m L蒸馏水中,每日1次,灌胃给药。4组均灌胃4周。给药期间密切观察大鼠皮肤毛色、精神状态、食欲情况、水肿情况、二便情况、舌色等—般情况表现。治疗期间,模型组大鼠死亡3只,赖诺普利组大鼠死亡2只,益气活血复方组大鼠死亡2只;空白对照组无大鼠死亡。—般情况表现,空白对照组大鼠表现为精神状态佳,活泼好动,食欲旺盛,毛发光亮,皮肤柔韧有弹性,四肢无水肿,二便正常。模型组表现为大鼠精神萎靡、反应迟钝、食欲不振,毛发枯稿、皮肤松弛无弹性,四肢水肿严重,尿量明显减少,大便稀溏,舌色绛紫,有瘀点、瘀斑等表现。两给药组表现为大鼠不好动,动作略欠灵敏,食欲稍减,毛发少光泽,皮肤略松弛,四肢轻度水肿,尿量略有减少,大便粘软有形,舌色绛紫,无瘀点、瘀斑等表现。3.给药结束后,行超声心动图检测各组大鼠心脏结构及功能情况(从模型组、赖诺普利组、益气活血复方组中随机抽取10只与空白对照组大鼠进行对比分析),包括:左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVIDs)、射血分数(EF)、心室短轴缩短率(FS)等指标;遂处死全部实验大鼠,取其心脏心肌组织。4.电镜下观察各组大鼠心肌组织超微结构。5.采用免疫组化法检测各组大鼠心肌组织中MMP-3、TIMP-3、OPN的表达。采用实时定量荧光PCR技术、蛋白印迹技术检测各组大鼠心肌组织中MMP-3、TIMP-3、OPN、TGF-β1及CTGF的表达水平。6.数据统计方法:采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析,计量资料以(X—±S)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为有差异统计学意义。结果:1.各组大鼠心脏结构及心功能情况与空白对照组比,模型组及两给药组(益气活血复方组与赖诺普利组)LVIDs、LVIDd明显升高,EF、FS水平明显下降,P<0.05,具有统计学意义;经药物干预后,两给药组(益气活血复方组与赖诺普利组)LVIDs、LVIDd较模型组明显下降,EF、FS水平明显升高,P<0.05,具有统计学意义。2.电镜下观察各组大鼠心肌组织超微结构空白对照组:心肌肌原纤维排列整齐,肌丝清晰排列规则有序;横纹清楚,线粒体形态正常,结构完整,线粒体膜结构清晰,内部嵴排列紧密,未见肿胀、空泡。模型组:心肌受损严重,表现为肌丝排列疏松、断裂,肌节欠完整,横纹欠清晰,部分线粒体肿胀、破裂,可见双层膜融合,模糊不清,并出现空泡,线粒体嵴断裂、融合,部分消失。益气活血复方组:肌丝排列较整齐,局部见肌丝紊乱,肌节尚规则,横纹略模糊,线粒体排列紧密,肿胀较模型组明显减轻,空泡较模型组明显减少,嵴结构较清晰,偶见线粒体溶解、消失。赖诺普利组:肌丝排列尚规整,局部可见肌丝走形紊乱疏松,肌节排列较规则,横纹欠清晰,线粒体排列紧密,肿胀较模型组明显减轻,空泡明较模型组显减少,嵴结构较清晰,可见个别线粒体溶解、消失。3.各组大鼠心肌组织MMP-3、TIMP-3表达情况3.1各组大鼠心肌组织MMP-3、TIMP-3的m RNA及蛋白表达:与空白对照组比,模型组及两给药组(益气活血复方组与赖诺普利组)MMP-3 m RNA及蛋白的表达明显升高,P<0.05,具有统计学意义;经药物干预后,两给药组(益气活血复方组与赖诺普利组)MMP-3 m RNA及蛋白表达较模型组明显下降,P<0.05,具有统计学意义。与空白对照组比,模型组及两给药组(益气活血复方组与赖诺普利组)TIMP-3 m RNA及蛋白表达明显下降,P<0.05,具有统计学意义;经药物干预后,两给药组(益气活血复方组与赖诺普利组)TIMP-3 m RNA及蛋白表达较模型组明显升高,P<0.05,具有统计学意义。3.2各组大鼠心肌组织MMP-3、TIMP-3免疫组化表达:与空白对照组比,模型组及两给药组(益气活血复方组与赖诺普利组)MMP-3的阳性表达明显增多;与模型组比,两给药组(益气活血复方组与赖诺普利组)MMP-3的阳性表达明显减少。与空白对照组比,模型组及两给药组(益气活血复方组与赖诺普利组)TIMP-3的阳性表达明显减少;与模型组比,两给药组(益气活血复方组与赖诺普利组)TIMP-3的阳性表达明显增多。模型组MMP-3免疫组化法经软件分析后其平均灰度值为161.23±8.02,其表达较空白对照组91.76±4.34明显升高,P<0.05,具有统计学意义;经药物干预后,益气活血复方组平均灰度值为126.58±6.43,赖诺普利组为127.24±6.49,两给药组较模型组表达明显下降,P<0.05,具有统计学意义;与空白对照组比,两给药组MMP-3免疫组化表达明显升高,P<0.05,具有统计学意义。模型组TIMP-3免疫组化法经软件分析后其平均灰度值为73.54±7.14,其表达较空白对照组152.72±10.24明显下降,P<0.05,具有统计学意义;经药物干预后,益气活血复方组平均灰度值为117.15±8.35,赖诺普利组为116.62±8.37,两给药组较模型组表达明显升高,P<0.05,具有统计学意义;与空白对照组比,两给药组TIMP-3免疫组化表达明显下降,P<0.05,具有统计学意义。4.各组大鼠心肌组织OPN表达情况4.1各组大鼠心肌组织OPN m RNA及蛋白表达:与空白对照组比,模型组及两给药组(益气活血复方组与赖诺普利组)OPN m RNA及蛋白表达明显升高,P<0.05,具有统计学意义;经药物干预后,两给药组(益气活血复方组与赖诺普利组)OPN m RNA及蛋白表达较模型组明显下降,P<0.05,具有统计学意义。4.2各组大鼠心肌组织OPN免疫组化表达:与空白对照组比,模型组及两给药组(益气活血复方组与赖诺普利组)OPN的阳性表达明显增多;与模型组比,两给药组(益气活血复方组与赖诺普利组)OPN阳性表达明显减少。模型组OPN免疫组化法经软件分析后其平均灰度值为113.36±11.73,其表达较空白对照组40.64±4.47明显升高,P<0.05,具有统计学意义;经药物干预后,益气活血复方组平均灰度值为73.31±7.17,赖诺普利组为72.86±7.85,两给药组较模型组表达明显下降,P<0.05,具有统计学意义;与空白对照组比,两给药组OPN免疫组化表达明显升高,P<0.05,具有统计学意义。5.各组大鼠心肌组织TGF-β1及CTGF m RNA及蛋白表达情况5.1各组大鼠心肌组织TGF-β1 m RNA及蛋白表达:与空白对照组比,模型组及两给药组(益气活血复方组与赖诺普利组)TGF-β1 m RNA及蛋白表达明显升高,P<0.05,具有统计学意义;经药物干预后,两给药组(益气活血复方组与赖诺普利组)TGF-β1 m RNA及蛋白表达较模型组明显下降,P<0.05,具有统计学意义。5.2各组大鼠心肌组织CTGF m RNA及蛋白表达:与空白对照组比,模型组及两给药组(益气活血复方组与赖诺普利组)CTGF m RNA及蛋白表达明显升高,P<0.05,具有统计学意义;经药物干预后,两给药组(益气活血复方组与赖诺普利组)CTGF m RNA及蛋白表达较模型组明显下降,P<0.05,具有统计学意义。结论:1.通过对大鼠行冠状动脉结扎术及配合力竭式游泳的方法建立的心梗后心衰大鼠模型(气虚血瘀证),经心电图、超声心动图检查及结合大鼠证候表现,证明本造模方法可行;益气活血复方可改善心梗后心衰大鼠的证候表现;这种“病证结合,方证对应,以方验证”的方法符合中医药动物模型的造模特征。2.通过超声心动图检测及电镜下观察心肌组织超微结构发现,益气活血复方可改善心梗后心衰大鼠心肌结构、心功能及受损的心肌组织,可抑制心室重塑。3.通过免疫组化法、实时荧光定量PCR、Western blot检测心梗后心衰大鼠心室重塑相关因子,即MMP-3、TIMP-3、OPN、TGF-β1及CTGF的表达发现,益气活血复方可下调心梗后心衰大鼠心肌组织中MMP-3、OPN、TGF-β1及CTGF的表达水平,可上调TIMP-3的表达;表明益气活血复方可通过调控上述心室重塑相关因子的表达,起到治疗心衰的作用。