论文部分内容阅读
目的肿瘤已经成为危害人类健康的常见病,然而由于对化疗药物的耐药和不良反应的发生,肿瘤的治疗效果始终没有达到人们的预期。中药以其独特的药理特性和作用机制,被广泛应用于肿瘤的治疗。中西医结合治疗方式是取“两家”之所长,从理论到临床实践多方位充分结合,以期达到最佳临床疗效。本文拟优化淫羊藿苷提取纯化方法,用网络药理学的方法研究其生物活性并进行体外细胞实验用胰腺癌细胞作出验证,然后通过研究淫羊藿苷对胰腺癌肿瘤微环境的调控进而发挥抑制胰腺癌发生发展的作用,来阐述中医药在肿瘤治疗方面的潜力。方法(1)大孔树脂制备淫羊藿苷:通过测定不同大孔树脂的吸附容量、吸附率和解吸附率优选出效率较高的大孔树脂,进行吸附动力学实验和吸附热力学实验,完成大孔树脂的筛选;通过动态泄漏量筛选,解吸附乙醇浓度筛选,解吸附乙醇用量筛选,完成大孔树脂的动态吸附-解吸试验;按照所得最优纯化条件对淫羊藿苷粗提物进行纯化。(2)淫羊藿苷潜在的生物活性:通过TCMSP数据库评估淫羊藿苷的药物动力学(ADME),利用Swiss Target Prediction工具进行淫羊藿苷靶标预测,利用GeneMANIA数据库进行靶标蛋白互作网络构建与分析,利用GO和KEGG数据库采用WebGestalt分析工具进行富集分析。(3)淫羊藿苷对胰腺癌细胞的直接杀伤作用(体外实验):通过划痕实验检测淫羊藿苷处理24h、48h后Panc 02细胞划痕的愈合情况;通过流式细胞仪,采用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测淫羊藿苷处理48h后Panc 02细胞的凋亡率。(4)淫羊藿苷对小鼠胰腺原位肿瘤及肿瘤微环境的影响(体内实验):建立小鼠胰腺癌模型,3天后予灌胃处理(玉米油或淫羊藿苷120mg/kg),连续处理11天,测量肿瘤大小和重量,检测脾脏和肿瘤中CD4+T细胞、CD8+T细胞、PMN-MDSC细胞、M2巨噬细胞的比例。(5)淫羊藿苷调控胰腺癌肿瘤微环境中M2巨噬细胞极化的机制研究:分离小鼠骨髓原代细胞并利用IL-4诱导其向M2巨噬细胞极化,淫羊藿苷处理24h,检测淫羊藿苷和IL-4单独诱导的M2巨噬细胞比例,并检测巨噬细胞极化过程中M2巨噬细胞特异性分子标记物(MRC1和ARG1)的表达;检测淫羊藿苷处理2h后及IL-4单独诱导RAW 264.7细胞向M2巨噬细胞极化过程中相关信号通路p-STAT6的表达。结果(1)淫羊藿苷制备:静态筛选结果显示HPD300为最优大孔树脂,选用HPD300进行了动态试验,淫羊藿提取物经HPD300树脂纯化后,淫羊藿苷的纯度为30.54%。进一步结晶得到纯度为95.49%的产物。(2)淫羊藿苷生物活性分析:GO和KEGG富集分析结果显示,淫羊藿苷可能具有调控细胞迁移、细胞运动、细胞通讯、肽酰-氨基酸修饰、蛋白质磷酸化、细胞内信号转导和细胞增殖等作用,同时调控多个肿瘤相关信号通路以及其他疾病信号通路如AGE-RAGE信号通路,Relaxin信号通路等。(3)体外实验:经100μM,150μM淫羊藿苷处理的Panc02的划痕愈合能力明显低于0μM淫羊藿苷组;与0μM淫羊藿苷处理48h后的细胞相比,100μM,150μM,200μM淫羊藿苷处理的细胞凋亡率明显增加。(4)体内实验:淫羊藿苷治疗组肿瘤的大小和质量显著低于对照组;淫羊藿苷治疗组M2巨噬细胞在肿瘤和脾脏中的比例均明显下降;淫羊藿苷治疗组PMN-MDSC细胞在肿瘤和脾脏中的比例也明显下降;而CD4+T细胞和CD8+T细胞在两组中未见明显差异。(5)机制研究:经20μM、80μM淫羊藿苷处理后:IL-4介导的骨髓原代细胞向M2巨噬细胞极化的比例明显减少,ARG1和MRC1的表达的表达明显减少。经80μM淫羊藿苷处理后,IL-4介导的RAW 264.7细胞中p-STAT6的表达明显下降。结论HPD300大孔树脂制备淫羊藿苷的方法简单有效。基于配体的靶标预测途径揭示淫羊藿苷可以针对多种蛋白质和途径,形成一个网络,发挥系统药理作用。体外和体内实验表明,淫羊藿苷能够通过抑制Panc02细胞的迁移和诱导凋亡来抑制胰腺癌的进展,还可以通过下调STAT6通路来调节免疫微环境中的M2巨噬细胞和PMN-MDSCs的比例。综上所述,淫羊藿苷可作为胰腺癌潜在的抗肿瘤和免疫调节药物。