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背景新生血管性眼病包括新生血管性青光眼、年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变以及角膜新生血管等,是可致盲的难治性眼病。目前的临床治疗方式很难达到理想的效果,基础研究方面也未能全面阐明其具体发病机制。因此,针对新生血管性眼病的科学研究是医学相关领域科研工作者必然使命。目前研究发现多种细胞因子及其受体表达水平的改变是新生血管性眼病发病极其重要的影响因素。正常情况下,促血管和抑血管因子的表达在组织内处于动态平衡状态。病理条件下,组织内各种细胞因子表达失调,平衡遭到破坏,浸润的巨噬细胞增多以及VEGF等促血管因子表达水平上升,促进血管内皮前体细胞分化和迁移,形成新生血管。生理条件下角膜是无血管的透明组织,但在炎症、化学烧伤、感染等病理状态下,角膜组织的结构和屏障功能受损,导致病变组织的炎症细胞和血管内皮祖细胞浸润,最终引起角膜新生血管形成。研究角膜新生血管发生的各种诱发以及参与因素有助于深入理解角膜新生血管的发病机制,为临床治疗相关疾病提供实验依据,也为其他新生血管性眼病发病机制的研究提供理论参考。研究发现,某些前炎症因子在促进炎症因子分泌、促进巨噬细胞和中性粒细胞等炎症细胞分化和迁移的同时,也促进其促血管因子分泌,达到间接促血管发生的所用。在这些前炎症因子当中,目前研究较多的是IL-17家族相关分子。它们具有很多独特的生物学特性。能诱导多种细胞分泌IL-6、IL-8、PGE2、金属蛋白酶-1、单核细胞化学趋化蛋白(MCP)-1和G-CSF等细胞因子,参与并放大炎症反应。研究显示IL-17A积极参与肿瘤的发病过程。IL-17A能促进固有免疫应答效应从而提高机体抗肿瘤能力,同时IL-17A还能通过促进肿瘤新生血管的发生促进肿瘤细胞的生长和转移从而一定程度抵消其抗肿瘤的免疫调节作用。目前IL-17A在角膜新生血管发生过程中的作用和机制的相关报道较少。鉴此,本文将从IL-17A参与炎症过程以及参与调节肿瘤新生血管发生等科学提示出发,研究IL-17A在实验性角膜新生血管形成过程中的作用及具体机制,为深入了解角膜新生血管性眼病的发病机理提供有价值的理论参考。第一部分IL-17A在角膜组织中的表达以及在角膜新生血管发生过程中的作用和机制目的探究IL-17A及其相关受体在角膜组织中的表达以及IL-17A在角膜新生血管发生过程中的作用和具体机制。方法选用BALB/c小鼠作为研究对象,采用NaOH碱烧伤法构建角膜新生血管模型;角膜局部滴用透明质酸钠配制的小鼠IL-17A重组蛋白、抗IL-17A中和性抗体、抗IL-17RA中和性抗体以及抗IL-17RC中和性抗体溶液进行干预,观察角膜新生血管的形成;收集碱烧伤后0天、2天、4天、7天的角膜样本,RT-PCR和western blot等法检测角膜组织内IL-17A及其受体动态表达,流式细胞术进一步检测IL-17A阳性表达细胞;全角膜铺片荧光免疫组织化学法检测角膜新生血管发生的面积;Real-time PCR和western blot等法检测角膜组织内VEGF、IL-6、IL-8、MCP-1等细胞因子以及FAK转录因子的表达;流式细胞术检测角膜组织内c-Kit阳性干细胞、F4/80阳性巨噬细胞以及Ly-6G阳性中性粒细胞迁移情况;分离培养角膜成纤维细胞以及Raw264.7巨噬细胞系,IL-17A蛋白及其中和性抗体干预后ELISA法检测其培养上清中IL-6和VEGF的表达水平。结果角膜新生血管模型构建2周后,新生血管形成数目达到高峰;IL-17A及其受体在角膜组织内存在动态表达,IL-17A在碱烧伤后不同时间点表达水平存在差异;流式检测结果显示IL-17A在碱烧伤角膜组织中表达细胞主要为γδT细胞;与对照组比较,IL-17A干预组角膜新生血管面积明显增多,IL-17A中和性抗体干预组和IL-17RA中和性抗体干预组角膜新生血管面积下降,IL-17RC中和性抗体干预组角膜新生血管面积无明显变化;Real-time PCR和western blot等方法证实IL-17A干预后,角膜组织内多种促血管因子VEGF、IL-6、MCP-1等表达显著升高(p<0.05);同时western blot法检测发现IL-17A干预组角膜组织内pFAK转录因子蛋白含量上升;流式细胞术检测结果显示,IL-17A干预组c-Kit阳性干细胞、F4/80阳性巨噬细胞以及Ly-6G阳性中性粒细胞迁移数目均较对照组增多,差异有统计学意义(p<0.05);体外干预实验发现IL-17A干预后,Raw264.7巨噬细胞以及角膜成纤维细胞分泌VEGF和IL-6能力显著提高,IL-17A中和性抗体干预后,其分泌能力受到相应抑制。结论IL-17A促进实验性角膜新生血管的形成;其机制与IL-17A促进巨噬细胞、中性粒细胞以及骨髓干/祖细胞迁移,促进炎症细胞和角膜成纤维细胞分泌促血管因子等作用相关。第二部分IL-17A对血管内皮细胞的直接作用和机制目的观测IL-17A对血管内皮细胞的生物学功能的影响,探讨IL-17A对新生血管发生的直接作用途径和机制。方法常规培养人视网膜血管内皮细胞系(HRECs);RT-PCR和western blot法检测细胞IL-17A相关受体的表达;基质胶(Matrigel)三维内皮细胞管腔成型法检测IL-17A对血管内皮细胞管腔形成的影响;Transwell法检测IL-17A对血管内皮细胞迁移的影响;CCK-8增殖实验检测IL-17A对血管内皮细胞增殖的影响;Real-time PCR以及western blot检测IL-17A对血管内皮细胞相关细胞因子以及转录因子基因和蛋白水平表达的影响。结果不同批次实验检测结果均显示HRECs内存在IL-17A相关受体基因和蛋白水平的表达;与对照组比较,IL-17A干预组HRECs管腔形成数目显著增多(p<0.05);增殖实验结果显示,不同浓度IL-17A干预后,HRECs增殖能力增强,与干预浓度呈剂量依赖性,100 ng/ml以及500 ng/ml IL-17A干预组,HRECs增殖水平较对照组有统计学差异,使用IL-17A中和性抗体后,其增殖能力受到明显抑制;Transwell实验结果显示100 ng/ml以及500 ng/ml IL-17A干预组HRECs迁移细胞数目显著高于对照组(p<0.05),使用IL-17A中和性抗体后,其迁移能力受到明显抑制;Real-time PCR以及western blot检测发现IL-17A促进血管内皮细胞自身VEGF、IL-6以及ICAM-1等细胞因子的表达,IL-17A同时还促进转录因子PI3K的表达(p<0.05)。结论IL-17A对血管内皮细胞具有直接效应,通过促进其管腔形成、增殖、迁移以及细胞因子的表达等途径促进新生血管的发生。