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酿酒葡萄是世界上主要的经济作物之一,多年来葡萄种植者在经济利益驱动下投入了大量肥料,适量施加氮肥可使葡萄枝叶繁茂,加速生长,并促进蛋白质和叶绿素的形成,增加养分的积累。同时,氮是葡萄酒酵母生长和发酵必需的营养元素,葡萄汁中氨基酸组成和含量受葡萄品种、产地、年份、气候、成熟度以及氮肥的使用等因素影响。从源头上了解酿酒葡萄微生物,为研究其对葡萄酒品质及安全的影响提供理论依据。获得主要结论如下:基于T-RFLP技术对不同酿酒葡萄品种根际和叶际细菌DNA扩增产物进行酶切图谱分析,根际T-RFs片段具体为72、73.3、74.6、91.5、103.7、114.8、118.1、419.4、421.3、448.7、453.6、455.2、475.2、482.6、593.6 bp。不同品种葡萄根际微生物优势菌群推测可能是74.6 bp的藤黄单胞菌属,根际Simpson指数最大的为白福尔（Fol）,最小的为长相思（Sau）,Shannon指数与Simpson指数基本保持一致。叶际T-RFs菌群片段具体为72、73.3、74.6、91.5、103.7、114.8、118.1、197.3、242、419.4、421.3、448.7、453.6、475.2、482.5、593.6 bp,叶际Simpson指数最大的为白诗南（Che）,最小的为米勒（Mul）,与Shannon指数基本吻合。由此推测,葡萄细菌群落结构综合多样性指数和品种以及定殖部位密切相关。基于Illumina技术发现,对9个酿酒葡萄品种果实表面的细菌16S rRNA基因V5-V7区以及真菌ITS1区进行PCR扩增和测序。在门的分类水平上,不同品种酿酒葡萄表面细菌主要分布在8个已知的门（排序不分先后）:变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、芽单孢菌门（Gemmatimonadetes）、醋杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）和Thermi。在属的分类水平上,不同品种酿酒葡萄表面细菌主要分布在6个属（排序不分先后）:欧文氏菌属（Erwinia）、假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus Cohn）、丙酸杆菌属（Propionibacterium）、Kaistobacter和小双孢菌属（Microbispora）。不同品种酿酒葡萄表面真菌多样性较少,仅分布在3个门:子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）和接合菌门（Zygomycota）。不同品种酿酒葡萄表面真菌主要分布在9个属（排序不分先后）:链格孢菌属（Alternaria）、枝孢属（Cladosporium）、茎点霉属（Phoma）、镰孢属（Fusarium）、耐冷酵母属（Guehomyces）、孢霉属（Mortierella）、隐球菌属（Cryptococcus）、附球菌属（Epicoccum）和漆斑霉属（Myrothecium）。基于Illumina HiSeq2500,分析葡萄浆果、叶际和土壤中细菌、真菌群落多样性,根际土壤、叶际和葡萄浆果中丰度最高的10个细菌门为放线菌（Actinomycetes）,变形菌（Proteobacteria）,厚壁菌门（Firmicutes）,芽孢杆菌门（Bacteroidetes）,Gemmatimonadete,酸杆菌门（Acidobacteria）,硝化螺旋杆菌门（Nitrospirae）,绿弯菌门（Chloroflexi）,疣微菌门（Verrucomicrobia）和浮霉菌门（Planctomycetes）。在这些菌门中,根际土壤中丰度最高的门为放线菌门（Actinomycetes,39.96%）,丰度最低的为浮霉菌门（Planctomycetes,0.17%）;叶际和根际丰度最高和最低的门相同,但丰度不同,即放线菌门（Actinomycetes,39.58%）,和浮霉菌门（Planctomycetes,0.14%）;浆果中丰度最高的门为变形菌门（Proteobacteria,40.55%）,根际、叶际和浆果上丰度最高的10个属为芽生球菌属（Blastococcus）,芽孢杆菌属（Bacillus）,节杆菌属（Arthrobacter）,Gaiella,铜绿假单胞菌属（Pseudomonas）,诺卡氏菌属（Nocardioide）,鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）,黄杆菌属（Flavobacterium）,Microvirg,Kocuria。相比于细菌群落的多样性,葡萄土壤、叶际和葡萄中真菌无论是在门水平还是属水平的真菌多样性均远低于细菌。所有的真菌分布在三个主要门（除了未被分类的门）:子囊菌门（Ascomycota）,担子菌门（Basidiomycota）和Chytridiomycota。所有样品中,丰度最高的门为子囊菌门（Ascomycota）。在土壤、叶际和葡萄中的占比分布高达66.59%,81.80%和76.64%。属水平上,土壤、叶际和葡萄中主要的属为链格孢属（Alternaria）,Guehomyces,枝孢菌属（Cladosporium）,隐球菌属（Cryptococcus）,茎点霉属（Phoma）,枝顶孢属（Acremonium）,镰刀菌属（Fusarium）,毛壳菌属（Chaetomium）,（Hydropisphaera）,Mycoarthris。链格孢属（Alternaria）在所有样品中是丰度最高的属,在土壤、叶际和葡萄中丰度分别为17.08%,22.21%和21.57%。土壤中丰度最低的真菌属为Mycoarthris（0.60%）,叶际和葡萄中丰度最低的属为Hydropisphaera,叶际中相对丰度为0.31%,葡萄中相对丰度为0.27%。由于葡萄酒的酿造由多种微生物共同参与,葡萄酒酿造的理化指标测定方法较多,但是产生这些化学物质的微生物的代谢过程缺乏相应的理论与方法学指导,因此基于稳定同位素质谱技术探讨了稳定同位素代谢流分析在葡萄发酵过程中的应用前景,建立了发酵液中氨基酸的氮同位素测定方法并探讨了15N标记的无机氮源替代氨基酸用于15N标记的代谢流分析方法,并用于精氨酸产生尿素的代谢流分析过程。并结合15N标记技术建立了稳定同位素示踪技术在微生物代谢流分析的方法学基础研究。在本研究中,为了确认氨基酸的保留时间,紫外检测器波长设置为205 nm,首先使用纯水作为流动相,分离出弱极性氨基酸,而含有强极性氨基酸物质在一个初始大峰中,然后收集使用同一个色谱柱用0.5 mM TFA作为流动相。系统中峰内同位素分馏的大小验证通过收集峰前、峰中和整个峰。前峰δ15N值（n=6）为-2.33‰,尾峰为6.47‰,整个峰值为2.26‰。前峰导致15N值的亏损,而尾峰则富集15N。由此表明,同位素分馏效应可导致在一个给定的物质峰中首先富集较轻的同位素,而后富集较重的同位素。分别加入0,0.01,0.02,0.05,0.1 g/L苯丙氨酸标准物质前处理。通过HPLC/EA-IRMS测定的苯丙氨酸δ15N值测定范围在8.17-8.25‰之间,标准误差为0.28‰。理论值和实测值随着苯丙氨酸标准物质的加入非常接近,线性相关系数R2=0.9511。为了进一步研究HPLC/EA-IRMS方法是否能够用于代谢流分析,使用1-10%15NH4Cl标记的无机氮源培养酿酒酵母,可以看出,随着15NH4Cl的加入,HPLC/EA-IRMS测定的苯丙氨酸δ15N值逐渐增加,测定值和加入的15NH4Cl线性相关,线性相关系数R2=0.9483。由此表明,HPLC/EA-IRMS方法可以用于15N标记的无机氮源以需要的规模直接用于15N标记的代谢分析。按照上述方法,探索了精氨酸代谢流,通过无机氮源和带标记的精氨酸相结合,得到88.57%精氨酸转化为尿素,由于尿素中氨基主要来源于精氨酸,因此推测发酵微生物酿酒酵母精氨酸代谢中有88.57%转化为尿素,说明该方法可以在氮标记中运用。