高效液相色谱-质谱联用测定土壤中氨基酸的方法研究

• 作 者: 孙敬
• 机 构: 东北大学
• 出 处: 东北大学
• 发表日期: 2004年期
• 关键词: 氨基酸 液相色谱-质谱法 土壤含量 土壤生态环境

在我国耕作土中有机态氮占全氮的90％-98％，氨基酸态氮是有机态氮的重要组成部分，占土壤全氮的20％-50％．。土壤中的氨基酸主要来源于微生物、动植物及其代谢产物等，是土壤的潜在氮源，直接或间接影响着土壤的肥力和持续供氮能力。通过了解土壤中氨基酸的种类和含量，可为作物的科学施肥管理、农业的合理化生产、新肥料的研制开发提供帮助，最大限度减少土地退化，实现农业可持续发展。而对土壤中氨基酸来源及转化的研究，将有助于研究土壤中氮素的转化及去向，并为提高氮肥利用率、保护土壤生态环境提供理论依据。
同位素稀释技术是研究氨基酸态氮来源及转化的有效手段，<'15>N同位素技术是进行特征含N化合物合成、分解过程及机制研究的首选方法，在土壤N素循环与转化研究中得到了广泛应用。但<'15>N同位素的测定需要新的技术支持，本研究旨在建立利用液相色谱-质谱测定土壤中氨基酸的方法，该法既可发挥色谱的高分离能力，又发挥了质谱对同位素的高鉴别能力，从而为借助稳定同位素示踪土壤氨基酸的研究提供了可靠、有效的分离分析和鉴定手段。
本论文建立了柱前衍生反相高效液相色谱-质谱法测定土壤中氨基酸的方法，该法采用AQC柱前衍生技术，以乙腈-水为流动相体系，甲酸-甲酸铵为添加剂，采用梯度洗脱、流速0.2mL/min、柱温35℃成功分离了18种氨基酸。用α-氨基丁酸为内标、二极管阵列检测器对氨基酸进行定量分析，检测限均低于0.50pmol/μL，发现各种氨基酸在50pmol/μL-800pmol/μL范围内具有较好的线性关系，除精氨酸、天冬氨酸外，相关系数均大于0.9992。此方法充分利用了质谱对同位素的高鉴别和可定量分析的优势，用带同位素标记的<'15>N-甘氨酸验证了该方法在测定同位素比例的准确性，相关系数大于0.9900，方法重现性RSD=2.31％，可基本满足质谱定量分析同位素比例的要求。
在氨基酸的色谱分析中，样品前处理是十分重要的步骤，直接影响分析结果的准确性和仪器的使用寿命。已有研究表明在土壤的水解样品中金属离子(如Fe、Al)和有机质是干扰色谱分离的主要因素。综上，本实验采用较常见的6mol/L HCl在105℃水解12小时的方法提取土壤中的氨基酸，并选用强酸型阳离子交换树脂对酸水解后的土壤样品进行纯化，用草酸将铁、铝等金属离子从树脂上洗脱下来，最终氨基酸的回收率在90％以上，表明该方法可满足测定需要。