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脊椎动物胚胎发育过程中,心脏是最早发挥功能的器官。由于斑马鱼(Danio rerio)早期胚胎透明、体外发育的优点,弥补了小鼠等动物胚胎体内发育的不足,有利于心脏早期发育的观察和操作,使其成为研究心脏早期发育和心脏疾病的理想模型。心脏发育是一个连续的过程,在整个发育进程中,有一些重要的事件,如心管形成、腔室分化、心脏环化和功能性瓣膜形成,在斑马鱼中,对应胚胎发育时间点为24、30、36和48 hpf(hours post fertilization)。本研究利用心肌细胞标记绿色荧光的Tg(myl7:EGFP)转基因鱼系,成功分离不同时间点(24、30、36和48 hpf)的完整心脏,以24 hpf的身体为对照,进行转录组测序分析,对斑马鱼心脏早期发育的调控基因以及调控网络进行研究。分析结果显示,在斑马鱼基因组编码的32,189个基因中,与身体相比,不同时间点的心脏约8.4-10.9%(2,696-3,523)的基因显著上调表达。GO富集分析显示,上调基因主要富集到心血管系统发育(GO:0072358)、心脏发育(GO:0007507)、心脏组织发育(GO:0048738)等生物过程。KEGG富集分析显示,上调基因主要富集到Wnt、Notch、肌动蛋白骨架调节等信号通路。相对于其它时间点,30 hpf时间点显著富集到多个信号通路,可能与激活更多的信号通路推动心脏发育的一个关键进程——心脏环化。相邻时间点可能需要相似数目的基因推动心脏的形态发生。4个时间点均显著上调表达的952个基因中,包含许多已知心脏发育的关键转录因子,如tbx家族、gata家族和nkx家族等。此外,筛选出34个心脏高表达的且用于qRT-PCR验证的候选基因。先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)是儿童致残和致死的首要原因。本研究总结了97个人类CHD致病基因,鉴定了其在小鼠和斑马鱼中的直系同源基因,并比较了基因在蛋白水平上的序列相似性。在转录组测序得到的93个CHD致病基因斑马鱼直系同源基因中,相对于身体,约50%的基因在心脏早期发育过程中显著上调表达。本研究对CHD疾病遗传诊断和利用斑马鱼疾病模型研究CHD发病机制研究具有重要的理论意义和实践价值。人类中KCTD(potassium channel tetramerization domain)蛋白有26个成员,在N端具有保守的BTB(Bric-a-brack,Tram-track,Broad complex,BTB)结构域,也称为POZ(poxvirus and zinc finger)结构域,但是却具有多变的C端。KCTD基因家族中成员的突变和表达异常与多种疾病相关。本研究选取人类皮肤-耳朵-乳头(scalp-ear-nipple,SEN)综合征致病基因KCTD1以及KCTD2和KCTD4基因在斑马鱼的直系同源基因kctd1、kctd2和kctd4,利用CRISPR/Cas9技术构建了基因的纯合突变体。据斑马鱼早期心脏转录组分析结果,结合人类疾病报道,选取人类糖原贮积病(GSD)致病基因的斑马鱼直系同源基因gys1、gys2和pygma利用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除。该研究为研究基因功能提供了基础资料。