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化疗在恶性肿瘤治疗中占有不可替代的重要位置,但多药耐药是导致化疗失败的主要原因,而导致多药耐药的原因还有待于进一步阐明。目前认为与肿瘤发生、转归有关的参与细胞凋亡的癌基因产物与化疗抵抗密切相关。肿瘤细胞对化疗药物的敏感与抵抗本质上都受到基因的调控。因此,从基因水平上比较耐药和敏感细胞间基因表达的差异,从细胞凋亡角度探讨耐药机理将有助于更深入的认识耐药机制,进而为克服或逆转耐药提供新思路。 主要技术路线:(1)采用大剂量药物间歇诱导法建立卵巢癌耐药细胞系OC3/Adr。通过MTT、FACS、Western blot和RT-PCR等方法鉴定OC3/Adr细胞的耐药指数、耐药分子的表达。(2)应用mRNA差异显示法筛选OC3/Adr细胞耐药相关基因。通过RT-PCR等方法证实差异表达片段。(3)构建PLXSN-Bcl-2逆转录病毒表达载体,建立卵巢癌OC3/Bcl-2高表达细胞系。通过Pl染色、琼脂糖凝胶电泳等方法观察细胞在抵抗药物诱导凋亡中的变化。(4)应用MTT、FACS、RT-PCR和Western blot等方法观察了Raji细胞抵抗阿霉素诱导细胞凋亡的分子变化。 主要结论:(1)建立了稳定传代的卵巢癌多药耐药细胞系OC3/Adr,产生耐药的机理为膜表面分子MDR1、MRP和LRP表达升高。(2)通过DD-PCR筛选到OC3/Adr细胞差异表达片段18条。其中四条进行了DNA序列测定,S1与精子蛋白高度同源,S2,S3和S4为未知片段。DT-PCR初步证实S2在耐药细胞高表达,在敏感细胞弱表达。S3在耐药细胞和敏感细胞中的表达未见差异,但在卵巢癌的表达升高。S3和S4已登录GenBank。(3)构建了卵巢癌Bcl-2高表达细胞系,该细胞系明显抵抗阿霉素诱导的细胞凋亡。(4)Raji细胞抵抗阿霉素诱导的细胞凋亡与化疗耐受密切相关,细胞浆中Bcl-2分子诱导性高表达,Bax、P53分子的弱表达是抵抗细胞凋亡的主要原因。