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鹅星状病毒(Goose astrovirus,GoAstV)是一种新型病原体,主要引起4-21日龄雏鹅内脏和关节痛风,病毒衣壳蛋白ORF2是GoAstV的主要保护性抗原蛋白。目前,GoAstV引起的痛风病的预防或治疗尚无有效疫苗和药物,所以,及早发现和准确诊断是预防该病流行、传播的重要手段。传统的电镜检测,酶联免疫吸附试验,RT-PCR相关分子生物学等检测方法各有一定的优缺点,因此,有必要建立一种快速、简单、专一、高效的诊断方法。即时检验(point-of-care testing,POCT)是指在现场进行的检测,通过试纸条反应,结合相应的小型分析仪从而可以第一时间得到结果的一种检测方法。该方法的原理是利用荧光微球标记抗体,通过抗原的免疫层析和毛细作用与抗体进行反应,将试纸条上T线和C线的荧光值利用分析仪读取并计算T/C的值,通过便携式分析仪器内置的标准曲线计算样品中待测抗原的含量。1、为了获得高纯度可溶性的GoAstV抗原,本研究将表达GoAstV部分衣壳蛋白ORF2核酸片段的重组质粒pGEX-4T-1-ORF2转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21感受态细胞中;经过条件优化后,在IPTG浓度为1.0mmol/L温度在30℃条件下诱导5h表达量最大,诱导后发现pGEX-4T-1-ORF2融合蛋白在上清中大量表达;经蛋白纯化试剂盒纯化后SDS-PAGE结果显示条带单一,大小为49.1KD;通过BAC法蛋白浓度检测试剂盒测定GoAstV-ORF2融合蛋白浓度为4.015mg/ml。2、为了制备与GoAstV抗原结合良好的多克隆抗体,将纯化后的GoAstV-ORF2融合蛋白通过常规免疫程序免疫2只大白兔,制备兔抗GoAstV-ORF2多克隆抗体。通过间接ELISA的方法检测制备的多抗其灵敏度良好且效价为1:25600;Western Blot结果显示,抗GoAstV-ORF2多克隆抗体与p ET-32a(+)-ORF2融合蛋白反应良好;通过间接免疫荧光组化试验检测临床GoAstV阳性组织固定的石蜡标本,有特异性荧光信号,这些结果表明制备的兔抗GoAstV-ORF2多克隆抗体与GoAstV抗原具有良好的反应性。3、为了建立检测GoAstV的POCT方法,利用Protein A/G-Sephrose FF亲和层析柱方法对制备的兔抗GoAstV-ORF2多克隆抗体进行纯化,纯化后有效Ig G的浓度为2mg/m L。以荧光微球标记兔抗GoAstV-ORF2多克隆抗体并作为样品垫和质控线的捕获抗体;以制备的鼠抗GoAstV-ORF2多克隆抗体为捕获抗体并作为检测线,进行组装POCT荧光微球免疫层析检测试纸条,并用纯化的GoAstV-ORF2融合蛋白倍比稀释后绘制标准曲线;将GoAstV感染的阳性血清和阴性血清分别滴入POCT检测试纸条,利用便携式分析仪器结合标准曲线进行检测。结果表明,建立的标准曲线基本符合要求,但特异性和稳定性还存在一定的差距。本研究成功制备了高纯度可溶性的GoAstV-ORF2融合蛋白和其兔抗GoAstV多克隆抗体,并以此初步建立了POCT荧光微球免疫层析定量检测GoAstV的方法。