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目的:
表达和纯化人ULBP3胞外段(aa30～177)融合蛋白,制备小鼠抗人ULBP3单克隆抗体,为进一步研究人ULBP3的生物学功能及临床应用奠定实验基础。
方法:
1.人ULBP3胞外段(aa30～177)基因的克隆和原核表达:采用RT-PCR方法,从人结肠癌细胞株COLO205中获得人ULBP3胞外段(aa15～177)基因,并克隆至pMD-18T载体,再转化至大肠杆菌DH5α,选择阳性克隆进行酶切鉴定和序列测定。从质粒hULBP3胞外段(aa15～177)-pMD-18T中扩增hULBP3胞外段(aa30～177)核酸序列,连接至表达载体pQE30上。经过测序鉴定,将阳性重组质粒转化至大肠杆菌M15,1mmol/LIPTG、30℃,4小时诱导目的蛋白表达;将表达的蛋白用Ni2+-IMAC柱进行纯化、复性,并通过WesternBlot进行鉴定。
2.单克隆抗体的制备:人ULBP3aa30～177融合蛋白免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术,将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合,并通过间接ELISA法筛选分泌小鼠抗人ULBP3抗体的杂交瘤细胞株,扩大培养并冻存。将成功分泌抗人ULBP3aa30-177蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞注射健康BALB/c小鼠腹腔内,两周左右产生腹水。腹水经ProteinG亲和层析柱进一步纯化后获得腹水型抗体。
3.单克隆抗体的鉴定:通过间接酶联免疫吸附试验、Westernblot,流式细胞术和对免疫组化染色对单克隆抗体进行鉴定。
结果:
1.成功克隆人ULBP3aa30～177基因,其编码区为444bp,编码148个氨基酸残基,与GenBank中公布的序列(NM_024518.1)完全一致。成功构建了hULBP3aa30～177-PQE30原核表达载体,表达相对分子质量约17kD的融合蛋白。该蛋白表达量高,复性后的hULBP3aa30～177蛋白浓度约为180pg/ml。经免疫小鼠血清效价的测定,证实该蛋白具有很强的免疫原性。WesternBlot结果显示所制备抗体能与原核表达蛋白hULBP3aa30-177×6His特异性结合。
2.间接ELISA法检测其抗血清效价,其效价大于1:1.0×106。杂交瘤细胞融合率为50%,经过间接ELISA法反复筛选,阳性率为16.7%,对其中2株杂交瘤细胞连续进行3次克隆化,获得两株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株B2-F1-F1和B4-C5-D11。两株单克隆抗体识别不同的抗原表位,其腹水效价分别为1:1.6×106(B2-F1-F1)和1:1.4×106(B4-C5-D11)。
3.Westernblot结果显示在27kD(细胞表达完整天然构象hULBP3蛋白的分子量)左右位置有目的条带,间接证明结合的分子是hULBP3。流式细胞术分析显示这两株抗体分别能识别人结肠癌细胞株COLO205和结直肠癌原代细胞ULBP3分子。免疫组织化学染色结果显示所制备的单克隆抗体也可识别结直肠癌组织标本细胞膜上ULBP3分子。验证了所制备的B2-F1-F1和B4-C5-D11单克隆抗体可识别细胞表面的ULBP3分子。
结论:
成功构建了原核表达载体pQE30-ULBP3aa30～177,并获得高纯度的人pQE30-ULBP3aa30～177融合蛋白;成功制备了小鼠抗人ULBP3分子的单克隆抗体。证实所制备的抗体不仅能识别人结肠癌细胞株COLO205,而且能特异地识别人临床结直肠癌组织细胞膜表面的ULBP3分子。hULBP3单克隆抗体的成功制备,为进一步深入研究人ULBP3分子的生物学功能及其在肿瘤发生发展中的作用创造了条件。