【摘 要】
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目的:以人胚胎椎间盘细胞为种子细胞,以PLGA材料为支架构建组织工程椎间盘。通过对人胚胎椎间盘细胞复合多孔支架进行组织形态学、细胞生物学、免疫组织化学研究,结合对椎间
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目的:以人胚胎椎间盘细胞为种子细胞,以PLGA材料为支架构建组织工程椎间盘。通过对人胚胎椎间盘细胞复合多孔支架进行组织形态学、细胞生物学、免疫组织化学研究,结合对椎间盘细胞与框架在体内、外的相互作用,不同复合细胞数量对人胚胎椎间盘细胞复合多孔支架影响的研究,构建与天然椎间盘生理功能相似的组织工程椎间盘并探索构建组织工程椎间盘的合适细胞接种数量。方法:(1)以纯化的PLGA为原料,通过热致相分离方法,制备成孔径50～300μm的球孔式结构。(2)从20周龄流产胎儿分离培养椎间盘细胞,传2代后接种于PLGA支架,通过MTT摄取、扫描电镜的方法进行体外观察,判断细胞与支架的复合情况及细胞的增殖、合成功能状况。(3)分别构建细胞接种数量为106(A组)、105(B组)、104(C组)及单纯支架(D组)的组织工程椎间盘各10个,每一支架需150μl细胞悬液。体外培养48小时后植入裸鼠背部皮下,4周后取材观察。通过形态观察、组织学观察、免疫组织化学染色、糖胺聚糖的生化测定比较不同细胞接种数量的复合物功能情况从而选择合适的细胞接种数量。结果:(1)热致相分离方法可将纯化PLGA原料制成PLGA多孔支架。所得的支架孔隙率较高,孔壁较薄,孔隙直径50～300μm,孔隙由中心向外呈放射状分布,孔隙形态、取向规则有序。(2)原代胎儿椎间盘细胞生长迅速,随传代次数增加,细胞极性逐渐增强,生长变缓;细胞-支架复合物加入MTT培养4小时后出现较为明显的显色反应。颜色随接种细胞数量增加而有明显的加深,C组复合物表现为均匀的淡紫色,B组复合物较前一结果有所加深并出现数个颗粒状深染区,而A组复合物呈现出均匀、浓密的深紫色;细胞-支架复合物体外培养48 h后扫描电镜下即可见大量细胞贴附于支架内,并可观察到少量细胞外基质合成。(3)3月龄裸鼠切开皮肤后皮肤与皮下组织分离较为简单,可顺利将支架植入皮下并缝合,所有皮肤缝线均在手术后两周内脱落,切口愈合良好;体内植入4周后,细胞-支架复合物仍保持其原有形状,而单纯支架植入组支架材料明显皱缩;细胞-支架复合物切片HE染色可见A组复合物内细胞数量明显高于其余两组实验组,A组及B组复合物内细胞多呈椭圆形或短梭形,而C组复合物内细胞极性明显增强,细胞呈长梭形沿支架生长,细胞外基质成分较少;免疫组化染色各实验组复合物均可观察到人Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白的合成,通过光密度对比分析,A及B组复合物Ⅱ型胶原蛋白的表达量明显高于C组,结果有统计学意义(P<0.01),而在Ⅰ型胶原蛋白的表达上,各组间无明显差别; BrdU染色检测证实实验组复合物内细胞为BrdU阳性细胞;A组及B组复合物内GAG的含量明显高于C组复合物,结果有统计学意义。结论:(1)PLGA支架具有良好的生物相容性,是构建组织工程椎间盘的合适选择;人胎儿椎间盘细胞在体外培养条件下可与PLGA支架完成良好的立体结合,细胞可顺利完成贴附及增殖。(2)A组及B组复合物合成Ⅱ型胶原及糖胺聚糖的能力明显优于C组,因此,A组及B组复合物有可能对退变椎间盘的修复起到促进作用。(3)构建组织工程椎间盘比较理想的细胞接种密度应该为10~5/150μl或高于这一密度。
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