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慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia,CML），简称慢粒，是一种起源于多能造血干细胞的恶性增生性疾病，在我国约占白血病的20％。其临床特点表现为粒细胞显著增高，脾肿大，骨髓粒细胞系统异常增生，以中幼粒以下的细胞增生为主，绝大部分CML具有特征性的费城染色体（philadelphia chromosome,Ph染色体）。Ph染色体是由9号染色体与22号染色体相互易位形成。在DNA水平，9号染色体断裂点远端的c—abl易位到22号染色体，与22号染色体断裂点近端的bcr基因融合形成了CML特异性的bcr-abl融合基因。该基因编码的p210融合蛋白具有异常的酪氨酸激酶活性，在CML的发病中起重要作用。 虽然骨髓移植（BMT）已改善了CML患者的预后，但由于诸如年龄和干细胞来源困难等因素的限制，仅有少部分患者有机会接受BMT治疗，且与BMT相关的并发症如严重感染、移植物抗宿主病（GVHD）、肝静脉栓塞（VOD）等发病率较高，仍有部分病人移植后复发。近年来针对Bcr／Abl融合蛋白的酪氨酸激酶的抑制剂—ST1571（也称gleevec,glivec或imatimb）的临床应用取得了明显疗效。然而，越来越多的研究证据显示ST1571治疗CML仍然存 第四军医大学硕士学位论文 在着明显的不足。 国内外很多作者越来越重视酪氨酸激酶活性以外的Bcr／Abl癌蛋白的其 它功能域及其相关的信号转导分子在CML恶性转化中的作用。如：Hawk 等用基因突变技术证明了Bcr－Abl癌蛋白Bcr区的丝氨酸－354的磷酸化对 BCf－Abl癌蛋白酪氨酸激酶活性具有负性调节作用：对与CML发生有关的信 号转导途径的抑制剂也进行了研究，如 RAS途径抑制剂一法尼基蛋白转移 酶抑末剂（Fmesyl pfoteill tfallsfCYAse idriibitorS）：pl－3K 途径抑韦剂一 一Wotmannin及其它酪氨酸激酶抑制剂一Genistein等，以及抑制剂联合作用．的体外实验，但结果都不甚理想。 PTD（蛋白转导结构域）是人类免疫缺陷病毒（HIV）J所编码的反式 激活蛋白TAT的一段多肽片段，具有独特的跨膜转运方式，其特点是转导速 度快，效率高。己经证明将 PTD融合于相对分子质量(MrV XIO二2 XIO’的 蛋白时，可介导这些蛋白从细胞外向细胞内直接跨膜转运。我们实验室利用 基因重组技术，将PTD与伙—abl sh3融合基因片段相连，构建了 PTD－her／abl Sh3 融合基因表达载体，并在大肠杆菌进行了表达，获得了一相对分子量为 23kD的PTD－BCR／ABL融合蛋白，并且证明此蛋白与HL－60细胞共同孵育 后及经尾静脉注射入小鼠体内，可自主进入细胞内。为了进一步了解基因重 组PTD－BCWABL融合蛋白对CML细胞的生物学作用，本课题组利用 PTD－her／abl融合蛋白进行了如下实验： 1．抗PTD．her／abl融合蛋白抗体的制备。利用PTD－her／abl融合蛋白免疫 新西兰兔，得到抗PTD七or／abl融合蛋白的多克隆抗体。经ELSA，免疫组 化，Wester七！N检验证实此抗体效价高，特异性强，可用于PTD七。r／abl融合 蛋白的进一步研究。 2．PTD．her／abl融合蛋白对K562细胞增殖及凋亡的影响。以前已经证 实，PTD．her／abl融合蛋白与K562细胞共同孵育后，司自主进入细胞内。我 －3－ 第四军医大学硕士学位论文 2．PTD．her／abl融合蛋白对K562细胞增殖及凋亡的影响。以前己经证 实，PTD七or／abl融合蛋白与K562细胞共同孵育后，可自主进入细胞内。我 们进一步研究发现，细胞与此蛋白共同孵育后，形态出现改变，生长受到抑 制，甚至在高蛋白浓度情况下，细胞发生凋亡。 3．PTD．her／abl融合蛋白对细胞周期及细胞周期蛋白的影响。将细胞与 此融合蛋白共同孵育后，运用流式细胞仪检测细胞周期，可发现随着培养时 间的延长，S 期细胞的比例逐渐减少，GZ期细胞的比例逐渐增多，提示 PTD－her／abl融合蛋白可使细胞阻滞在GZ期。经Western—Blot检测细胞周、期蛋白，发现 PTD七0尼bl融合蛋白并不影响细胞周期蛋白 DI的表达。 4．PTD－her／abl 融合蛋白对K562 细胞端粒酶的影响。为了了解 PTD．her／abl融合蛋白对K562细胞的作用机制，我们检测了在不同培育时间 细胞端粒酶的变化情况。结果证实，此蛋白对K562细胞的端粒酶无影响。 通过本实验，制备了抗PTD－her／abl融合蛋白多克隆抗体，井且证明此抗 体无论在特异性或者效价上均足可应用于此蛋白的进一步研究；发现此蛋白 对K562细胞的增殖有明显的抑制效应，在较大剂量时还可出现诱导细胞凋 亡的作用；流式细