NOD样受体蛋白6的LPS识别机理及其两步激活模式研究

• 作 者: 冷方伟
• 机 构: 中国科学院大学
• 出 处: 中国科学院大学
• 发表日期: 2015年期
• 关键词: 天然免疫受体 识别机理 激活模式 致病因子

天然免疫受体是机体抵御病原微生物入侵和组织损伤的第一道防线，在机体非特异性免疫过程中起着重要作用，对特异性免疫应答的启动和调节也具有重要意义。天然免疫应答的启动依赖于模式识别受体对病原相关分子模式的识别。病原相关分子模式包括病原微生物表面某些共有的高度保守的分子结构，以及宿主凋亡细胞表面某些共有的特定分子结构。作为天然免疫受体家族的重要一员，NOD样受体(Nod-like receptor，NLR)定位于细胞质内，在识别侵入到胞质内的病原微生物相关致病因子继而启动天然免疫应答的过程中起着至关重要的作用。然而，包括NLRP6在内的许多NLR蛋白家族成员所识别的配体还没有被鉴定出来。研究显示，NLRP6能调节肠道菌群组成，维持肠道内环境稳定，也能抑制肠道慢性炎症，防止肠癌，非酒精性脂肪肝等疾病的发生，还能促进肠道组织增殖和损伤愈合。本论文中，我们纯化得到了高纯度的NLRP6单体样品，三维电镜重构结果显示NLRP6单体在整体结构上呈“6”的形状。结合分析型分子筛和负染电镜的工作，我们发现脂多糖(Lipopolysacchride，LPS)能引起NLRP6单体的二聚化，在ATP存在的情况下，NLRP6二体能进一步聚集形成四体，六体，乃至更高形式的聚集体。SPR实验和活细胞成像的结果进一步证明了NLRP6与LPS之间的相互作用。根据电镜三维重构的结构模型，NLRP6的各种高聚体都是以二体为基本结构单元头尾相接而成，相邻的二体之间存在120°的角度偏转。另外，我们还发现Hela细胞内过表达的NLRP6会在LPS的诱导下出现聚集，若同时在细胞内表达ASC，则ASC会被NLRP6聚集体募集到一起而形成更大的聚集体。结合体内和体外的实验结果，我们提出了NLRP6的两步激活模式，即NLRP6在识别胞质内的LPS后先形成二聚体，再在ATP的诱导下以线性延伸的方式自组装成高聚体，继而募集ASC等接头蛋白以形成炎症小体或其他形式的信号复合物。　　本论文还用电镜对NLRP10的结构及其自组装方式进行了初步研究。NLRP10是NLR蛋白家族的特殊成员，它不具有LRR结构域，因此目前的观点认为NLRP10可能并不直接参与病原微生物致病因子的识别，而是行使免疫调节的功能。先前的研究表明NLRP10能促进NOD1介导的免疫反应，也能负调控NLRP3炎症小体的激活。本论文在纯化全长人源NLRP10时，同时得到了NLRP10缺失PYD结构域后的稳定蛋白片段，电镜结果显示，存在降解条带的NLRP10样品有条形和环形两种形态，PYD结构域的缺失导致了NLRP10自组装方式的改变。通过序列分析和定点突变，我们找到了潜在的蛋白降解位点，从而解决了纯化过程中蛋白降解的问题，为后期的高分辨结构测定奠定了基础。