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人巨噬细胞移动抑制因子(Human macrophage migration inhibitory factor, hMIF)是一种重要的免疫调控细胞因子,组成性表达于全身多种组织,其主要来源是垂体前叶细胞、活化的T淋巴细胞、单核巨噬细胞等。hMIF基因编码区含353bp,编码由115个氨基酸残基组成、分子量约为12.5kD的非糖基化蛋白。除细胞因子的基本功能外,hMIF还具有类似激素、生长因子、应激反应蛋白及糖基化抑制因子(glycosylated inhibitory factors, GIF)等的多重作用,并可调节机体的免疫应答。近年来研究发现和证实,hMIF可促进感染性休克、风湿性关节炎等感染性、自体免疫性疾病以及肿瘤的发生发展。此外,hMIF还可加速创伤后的组织修复。故本文hMIF的原核表达和抗hMIF单克隆抗体的制备研究将为上述疾病的诊断和治疗提供新的机遇。 主要的研究内容和结果: 1.hMIF基因的克隆和原核表达 (1)根据GenBank发表的hMIF cDNA序列设计了一对特异引物,经RT-PCR从人乳腺癌细胞株MDA-MB453和人乳腺癌组织扩增hMIF cDNA,琼脂糖凝胶电泳发现扩增出全长为353bp的hMIF基因片段;凝胶回收试剂盒回收PCR产物并将其构建到原核表达载体pET11b中,测序表明所克隆到的hMIF序列与GenBank发表的hMIF cDNA序列完全一致。 (2)重组质粒pET11b/hMIF转化大肠杆菌BL21(DE3),按IPTG的作用时间分组诱导hMIF蛋白的表达;Tricine SDS-PAGE可见,与未诱导组相比,IPTG诱导组细菌有一条分子量约为12.5kD的特异蛋白条带,与hMIF蛋白的预计分子量相符;诱导6h时蛋白表达量最高,约占细菌总蛋白的30%。将表达菌破菌离心后分别取细菌上清和沉淀电泳,证实该蛋白为可溶性表达。 (3)将BL21重组菌(pET11b/hMIF)诱导发酵,超声破菌;1g湿菌经阳离子交换和疏水层析可得到约53mg纯度为95.40%的hMIF,得率约为17.7%,纯化的蛋白浓度为1.145g/L,Western blotting结果表明纯化的hMIF蛋白能与鼠抗hMIF单克隆抗体形成特异性条带。