论文部分内容阅读
细菌素CAMT2是分离自海洋宝石石斑鱼肠道的解淀粉芽孢杆菌ZJHD-06（Bacillus amyloliquefaciens ZJHD-06）产生的一种抗菌谱广、热稳定性与pH稳定性强的肽类物质。本课题通过对产细菌素CAMT2发酵培养基的优化获得高抗菌活性发酵液，并对发酵上清液进行一系列的分离纯化，获得一定纯度的细菌素CAMT2，最后对分离纯化的细菌素CAMT2进行抗菌机理研究。研究结果如下：（1）解淀粉芽孢杆菌产细菌素CAMT2发酵培养基的优化：以抑制弯曲芽孢杆菌（Bacillus flexus）的效价为抗菌活性评价指标，以从7种培养基中筛选出的TGE培养基作为发酵优化的基础发酵培养基，对选择的16个因素设计Plackett-Burman实验，筛选出葡萄糖、FeSO4、Vc3个主效因素，再通过最陡爬坡实验分别确定7.00g/L、0.09mg/L、0.65g/L作为中心水平，并设计了Box-Behnken实验。对实验结果运用JMP软件分析得出最佳配比，即葡萄糖7.15g/L、FeSO40.11mg/L、Vc0.69g/L、胰蛋白胨10.0g/L、酵母膏10.0g/L；通过验证实验证实，优化后的发酵培养基所产发酵上清液的抗菌效价是原始TGE培养基的2.1倍。（2）解淀粉芽孢杆菌细菌素CAMT2分离纯化：细菌素CAMT2分离纯化分为硫酸铵沉淀、SephadexG-50柱层析、SDS-PAGE电泳、蛋白胶条鉴定4个步骤。通过20%~80%饱和度的硫酸铵沉淀实验，确定了发酵上清液最佳沉淀饱和度为60%。沉淀的蛋白用磷酸缓冲液溶解、透析后过SephadexG-50柱，洗脱液为0.01mol/L pH7.0磷酸缓冲液，对每管收集液在吸收波长275nm下检测吸收值，并绘制洗脱曲线。洗脱曲线表现出两个洗脱峰，检测第一个峰收集液（F1）和第二峰收集液（F2）的抗菌活性后发现F1无抗菌活性，F2抗菌活性明显。F2收集液用超纯水透析后真空冷冻干燥，干燥后粉末用磷酸缓冲液溶解并进行SDS-PAGE电泳，结果显示仅有分子量约20kDa的一条蛋白条带。将这一蛋白条带经处理后交于华大基因(BGI)进行全质谱分析及蛋白鉴定，鉴定结果表明存在5种蛋白，经过比对和分析得知分子量为19608.57Da、N末端氨基酸序列为MKIARTAIGSCLALSLTIPF的2号蛋白和分子量为20265.57Da、N末端氨基酸序列为MKKWLLFLTTITLILSLGTA的3号蛋白为分离的目的蛋白。（3）解淀粉芽孢杆菌细菌素CAMT2抗菌机理研究：实验从对Bacillus flexus的生长抑制状况、细胞形态变化、细胞膜通透性的影响三个方面探讨细菌素CAMT2的抗菌机理。通过绘制Bacillus flexus的生长抑制曲线发现细菌素CAMT2对Bacillus flexus的生长抑制作用明显，并且出现部分溶菌现象；运用扫描电镜观察到被作用前后细胞形态发生了显著变化，作用后的细胞两端变尖，细胞边缘成锯齿状，部分细胞破裂；在对细胞膜通透性的影响方面，实验测定了电导率、胞内外K+浓度、乳酸脱氢酶和紫外吸收物质的浓度，结果发现经细菌素CAMT2作用后的Bacillus flexus的胞外电导率和胞外K+浓度在0.5h内迅速增加，而胞内K+浓度在0.5h内迅速降低，这说明细菌素CAMT2能快速高效地对细胞膜造成损伤。胞外乳酸脱氢酶和紫外吸收物质在作用3h后，存在明显上升的趋势，这说明细菌素CAMT2对细胞膜造成的损伤程度已经能使胞内的大分子物质泄漏，最后导致细胞死亡。