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利用DNAStarProtean软件对GenBank上发表的奶牛Hsp72完整氨基酸序列的抗原位点进行分析,选取其中抗原性较好的区域,根据其对应的DNA序列设计一对引物,上下游引物两端分别有EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点。以从奶牛血中提取的总DNA为模板,用PCR方法扩增该基因片段。将扩增得到的基因克隆到pMD18-T载体上,构建pMD-18T/Hsp72重组质粒,转化E.coliDH5α,对经蓝白斑筛选和PCR鉴定出的阳性克隆进行序列测定,应用BLAST和DNAStar软件对所测序列进行分析。利用内切酶EcoRⅠ和HindⅢ酶切pMD-18T/Hsp72重组质粒,将切下的目的片段插入pET-32a-c(+)载体,构建pET-32a-c(+)/Hsp72重组质粒,重组质粒经PCR和酶切鉴定为阳性后,转化宿主菌E.coliBL21。利用IPTG诱导表达,并摸索最佳的诱导条件。通过SDS-PAGE电泳和Westernblotting对重组蛋白进行分析和鉴定。利用亲和层析提纯蛋白,免疫BLAB/C系小鼠。建立检测奶牛Hsp72抗体的间接ELISA筛选方法,应用杂交瘤细胞融合技术将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0和经重组蛋白（奶牛Hsp72）免疫过的小鼠脾细胞融合,利用建立的间接ELISA方法对融合细胞进行筛选,选取阳性细胞应用有限稀释法进行亚克隆。试验结果如下:
1.用PCR方法成功克隆了541bp的奶牛Hsp72DNA片段(GenBank登录号为EU038069),经BLAST分析,与GenBank已发表序列同源性为99.3％,共有2个位点发生突变,氨基酸序列同源性为100％,蛋白二级结构分析显示,该蛋白属于可溶性蛋白,蛋白抗原性好。
2.SDS-PAGE电泳显示,原核表达产物的分子质量约为37kD,与预计大小相符,对表达重组蛋白进行可溶性分析,证实该蛋白以包涵体和可溶性两种形式存在。最佳诱导条件为:0.3mmol/LIPTG,25℃,8h;经Westernblotting试验进一步证实,该重组蛋白具有奶牛Hsp72反应原性,命名为“奶牛Hsp72”。
3.间接ELISA最佳反应条件为:奶牛Hsp72、商品奶牛Hsp72为包被抗原浓度分别为1.5μg/ml,2.0μg/ml,1％BSA做封闭液。最佳阳性血清稀释度为1∶1.6×104,StressgenHsp72单克隆抗体的最佳稀释度为1∶400（2.5μg/ml）,抗原抗体反应时间为90min,1％BSA作为封闭液,含0.5％的吐温-20作为洗涤液。羊抗小鼠IgG-HRP最佳稀释度为1∶3×104（6.7×10-2μg/ml）,作用时间为60min。细胞融合后能够筛选到阳性克隆,细胞融合成功。但克隆后没有检测到阳性孔;重复亚克隆三次,依然没有检测到阳性孔。