论文部分内容阅读
禽呼肠孤病毒(Avian reovius,ARV)属于正呼肠孤病毒科(Reoviridae),正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)。ARV感染鸡引起的主要病症有鸡的病毒性关节炎、腱鞘炎及矮小综合征等,除导致死亡和生产性能下降之外,该病还可诱发免疫抑制,导致机体对疫苗的免疫应答和多种病原体的抵抗能力显著降低。由此可见,ARV感染对养禽业的危害极大,给养禽业者造成了巨大的经济损失。ARV是一种不含囊膜的双链RNA病毒,其基因组由10个RNA基因片段组成,可以编码病毒的八种结构蛋白(λA、λB、λC、μA、μB、σA、σB和σC)及四种非结构蛋白(μNS、σNS、p10和p17)。其中,σA蛋白是由S2基因编码,介于外衣壳μBC蛋白和内衣壳λA蛋白之间的结构蛋白,它能够促进ARV内、外层衣壳结构的稳定。σA蛋白可以通过与dsRNA序列相结合的方式来抑制蛋白酶的活化过程,从而抑制细胞内干扰素的分泌,协助病毒粒子躲避宿主细胞内的免疫防御;在病毒侵染的过程中,σA蛋白可以通过其水解酶的活性作用作为病毒转录和复制的能量来源;σA蛋白还可以对宿主细胞内的信号通路进行调节,促进病毒在宿主细胞内的感染复制;此外,该蛋白在病毒粒子的装配过程中也承担着重要角色。在被病毒侵染的细胞中,病毒编码的蛋白和宿主蛋白之间存在着一定的联系,从而影响着病毒的感染致病过程,因此,开展ARVσA蛋白及其互作蛋白的研究对探讨ARV的致病机理具有十分重要的意义。HSP70、HSP40、RPL4蛋白均是宿主细胞内高度保守且具有重要生物学作用的蛋白。HSP70和HSP40蛋白具有分子伴侣的功能,目前对这两种蛋白与病毒蛋白的相互作用研究较多,已知猪源HSP70和人源HSP40蛋白可以在病毒入侵的过程中保证蛋白质的正确折叠和组装,促进病毒在体内的复制和增殖;而RPL4蛋白可以参与核糖体的装配过程,且禽源RPL4蛋白可以参与病毒的入侵过程。本实验室前期通过蛋白组学和酵母双杂交研究发现禽源HSP70、HSP40和RPL4蛋白与ARVσA蛋白存在一定联系,因此本研究选取这三个蛋白作为研究与ARVσA蛋白相互作用的宿主蛋白。本研究构建了pEF1α-HA-σA、pEF1α-Myc-HSP70、pEF1α-Myc-HSP40(DNAJB6)、pEF1α-Myc-RPL4真核表达重组质粒,并对所构建的真核表达重组质粒进行菌落PCR验证、双酶切验证和测序验证,结果显示,pEF1α-HA-σA、pEF1α-Myc-HSP70、pEF1α-Myc-HSP40(DNAJB6)、pEF1α-Myc-RPL4真核表达重组质粒构建成功。将所构建的真核表达重组质粒转染到人胚肾细胞(HEK293T)中进行蛋白的表达,并通过间接免疫荧光和Western blot试验对所表达的目的蛋白进行验证,结果表明:HA-σA、Myc-HSP70、Myc-HSP40(DNAJB6)、Myc-RPL4融合蛋白均可在HEK293T细胞中正确表达。将构建的pEF1α-HA-σA真核表达重组质粒分别和pEF1α-Myc-HSP70、pEF1α-Myc-HSP40(DNAJB6)、pEF1α-Myc-RPL4真核表达重组质粒在HEK293T细胞中共同表达目的蛋白,并通过免疫共沉淀试验验证病毒蛋白与所选宿主蛋白的相互作用,免疫共沉淀的结果显示:ARVσA蛋白与禽源HSP70和RPL4蛋白的相互作用结果为阴性,ARVσA蛋白与禽源HSP40(DNAJB6)蛋白有单向互作的阳性条带,即以兔源HA标签抗体为一抗进行免疫共沉淀,以鼠源Myc标签抗体为一抗进行Western blot检测有阳性条带,但反向免疫共沉淀试验条带不够明显。本研究推测ARVσA蛋白与禽源HSP40(DNAJB6)蛋白存在相互作用的关系,对此还需进行更进一步的研究。本研究为进一步探讨ARV的致病机理创造了条件。