佐夫色绿藻高效积累虾青素的诱导调控机制研究

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虾青素是一种具有超强抗氧化活性的酮基类胡萝卜素。佐夫色绿藻(Chromochloris zofingiensis)可在诱导条件下高效积累虾青素,是天然虾青素生产的重要替代藻种。本研究针对佐夫色绿藻胞内虾青素高效积累的诱导条件及其调控机制进行了深入系统研究。首先建立了佐夫色绿藻胞内虾青素含量的快速无损检测技术,成功筛选到最佳的诱导条件;随后采用代谢组学和多元变量统计分析技术,阐明了该诱导条件下细胞的调控机制。主要研究结果如下:(1)基于佐夫色绿藻细胞自发荧光特性与色素含量之间的相关性,采用线性回归分析,建立了胞内虾青素含量的快速无损检测方法,同时实现了Car/Chl比值的快速检测。方法学研究表明,该快速检测技术具有较好的精密度和准确度,可满足快速、无损、实时分析的要求。(2)在摇瓶和微孔板培养体系中进行佐夫色绿藻混养培养,比较研究了不同光质、光强以及氮源浓度对于胞内虾青素积累的影响。结果表明:采用低光-高光两阶段光照培养,最有利于摇瓶中细胞积累虾青素。在微孔板培养体系中,当采用光强为150μmol m-2 s-1的蓝光照射培养,相对于同样强度的白光照射而言,更有利于虾青素的诱导合成。但当光强从150μmol m-2 s-1提高到300μmol m-2 s-1时,高强度蓝光导致细胞生长和虾青素合成均受到显著抑制。与蓝光诱导不同,300μmol m-2 s-1高白光和完全无氮培养时,胞内虾青素含量可以达到7.11 mg/g,产量为30.6 mg/L。此外,在同样条件下,添加0.1g/L氮源进行高光-低氮培养时,可兼顾生物量和虾青素积累量,获得最高38.91 mg/L的虾青素产量,相比提高了27.1%。(3)基于虾青素快速无损检测和微孔板诱导培养系统,进一步筛选出了能显著提高佐夫色绿藻积累虾青素的诱导条件。结果表明,在众多诱导条件中,添加生长素(吲哚丙酸IPA)和脱落酸(ABA)对于诱导虾青素积累效果最显著(p<0.05),其中IPA可以将虾青素含量提高到13 mg/g以上,这是当时国际上的的最高水平,但细胞生长受到了显著抑制。添加吲哚乙酸(IAA)和丙酮酸(Py)可以实现生物量和虾青素同步积累,胞内虾青素产量也达到最高(87.0 mg/L),极显著提高了虾青素的生产能力。(4)针对生长素(吲哚丙酸IPA)诱导过程中细胞生理生化变化规律进行了深入分析。结果表明,细胞经过IPA诱导后,叶绿体及其类囊体结构基本消失,油滴大量积累。相对于对照组,细胞对于葡萄糖吸收被严重抑制,脂类积累也受到抑制,叶绿素降解速率被抑制,但是虾青素含量有显著增加,最高可以达到13.9 mg/g,虾青素产量为49.6mg/L。(5)采用基于气相-飞行时间质谱(GC-TOF-MS)的代谢组学分析技术和正交偏最小方差判别分析(OPLS-DA),成功鉴定出了156种佐夫色绿藻响应生长素(吲哚丙酸IPA)诱导的主要代谢标志物,绘制了佐夫色绿藻响应IPA诱导的中心代谢网络图。结果表明,IPA诱导下胞内代谢标志物是碳水化合物类、氨基酸和脂肪酸,涉及到主要代谢通路途径有半乳糖代谢途径、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢途径、不饱和脂肪代谢途径、淀粉/蔗糖代谢途径以及谷胱甘肽代谢途径等。从中心代谢网络图可知,IPA诱导条件区别于高光-缺氮对照组的最大差别在于:糖酵解途径和氨基酸代谢均受到抑制,氨基酸和叶绿素的降解代谢被抑制,胞内氮源的提供因而受到限制,进而导致TCA途径中代谢产物积累,脂肪酸的延长和脱饱和作用也受到抑制,最终显著促进了细胞内虾青素的高效积累。研究结果对于深入理解微藻响应环境胁迫和抗胁迫生存的调控机制具有重要理论意义。
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