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背景:心肌纤维化(MF)是慢性心功不全难以逆转的原因之一,且MF的程度决定着患者的预后。因此预防和逆转MF成为心力衰竭治疗的重点之一。心肌成纤维细胞是MF主要效应细胞,其过度增殖和胶原蛋白合成降解失衡是MF初始因素。RAS系统在促进MF发生发展过程中有着重要作用。AngⅡ可以激活TGF-β1信号,增加胶原蛋白合成,在MF和心肌重塑中起着关键作用。AngⅡ主要与ATI受体结合。缬沙坦是高选择的ATI受体拮抗剂,能够阻断AT1受体促进细胞增长、促进醛固酮释放和收缩血管的作用。线粒体单链DNA结合蛋白1(SSBP1),属于单链DNA结合蛋白家族。通过与线粒体单链mtDNA结合,在线粒体DNA复制、重组和修复中发挥重要作用。研究发现SSBP1可能是TGFβ-1的负调控因子,并在心肌成纤维细胞活化中起到抑制作用。P53是一种转录因子,主要作用在于在维持线粒体功能,调控细胞增殖和分化。有研究发现SSBP1可以通过乙酰化增强P53稳定性。因此我们推测可以通过SSBP1/P53抑制心肌纤维化。第一部分 小鼠心肌纤维化模型制备目的:采用外源性给与AngⅡ的方法制备小鼠心肌纤维化模型。方法:C57BL/6J小鼠,23只,皮下置入ALzet 2002 200ul渗透泵。对照组(n=12),泵入稀释后乙酸。实验组(n=11)泵入乙酸稀释的Ang Ⅱ,1.44μg/g/d,2周后检测小鼠血压,心脏超声相关指标。处死小鼠,制备心脏组织切片行天狼星红染色并测定胶原染色面积。结果:AngⅡ能够使小鼠收缩压升高,心脏重量增加,室壁增厚。实验组心肌组织切片胶原纤维染色面积为19.4%,对照组为42.1%。(P<0.05)第二部分 缬沙坦通过SSBP1抑制AngⅡ诱导的心肌纤维化目的:①探究SSBP1是否参与MF。②缬沙坦是否通过SSBP1干预MF。方法:C57BL/6J小鼠,植入ALzet2002 200ul渗透泵,对照组(n=12),泵注稀释后乙酸;实验组(n=11)泵注AngⅡ;缬沙坦组(n=11)泵注AngⅡ+灌注缬沙坦(40 mg/kg/d)。泵注量1.44μg/g/d,2W。①心肌组织切片行天狼星红苦味酸染色,用图像J软件定量染色面积。②检测心肌COL1A1、COL3A1、SSBP1蛋白(WB法)和mRNA(qRT-PCR法)。③检测心肌组织线粒体功能。包括比色法测柠檬酸合成酶、ComplexⅠ和ComplexⅢ、GSH-Px活性。和NBT法测SOD活性。qRT-PCR法测Nox1和Nox4 mRNA。④分离并培养MCFs分4组:空白对照;AngⅡ0.5umol/l 组;AngⅡ 1.0umol/l组;AngⅡ 1.0umol/l+缬沙坦1.0umol/l 组;WB 法检测组 COL1A1、COL3A1、NOX1、NOX4 以及 SSBP1 蛋白。结果:①与对照组相比较,Ang II使得胶原蛋白染色面积、COL1A1和COL3A1 mRNA以及蛋白表达增加。柠檬酸合成酶、复合物I和复合物III、SOD和GSH酶活性降低;Nox1和Nox4 mRNA表达增加。SSBP1表达减少。②相比于实验组,缬沙坦组胶原蛋白染色面积、COL1A1和COL3A1 mRNA以及蛋白表达明显减少。柠檬酸合成酶、复合物Ⅰ和复合物Ⅲ、SOD和GSH酶活性增加;Nox1和Nox4 mRNA合成降低;但是SSBP1表达则有所增加。第三部分 P53和SSBP1对Ang Ⅱ刺激的MCFs增殖能力和胶原蛋白合成的影响目的:明确SSBP1是否能够通过P53抑制AngⅡ诱导的MCFs增殖和胶原蛋白表达。方法:(①沉默(感染SSBP1shRNA)和上调SSBP1(转染PCDNA3.1SSBP1),分别在有和没有AngⅡ刺激的情况下,MCFs增殖能力(MTT法)、Ⅰ型Ⅲ型胶原蛋白表达、NADPH氧化酶NOX1和NOX4合成、以及P53蛋白表达的变化(蛋白检测使用WB法)。②感染Ad-P53-GFP上调P53,分别在有和没有AngⅡ刺激时,MCFs增殖能力、COL1A1和COL3A1、NOX1和NOX4表达的变化。结果:①沉默SSBP1,P53蛋白合成减少,并使得AngⅡ诱导的MCFs增殖和胶原蛋白表达更加明显;上调SSBP1,P53蛋白合成增多,并使得AngⅡ诱导的MCFs增殖和胶原蛋白表达受到抑制。②调控SSBP1不影响Nox1和Nox4表达。③上调P53可抑制MCFs增殖和胶原蛋白表达。全文结论:1.AngⅡ诱导的MF中SSBP1表达受抑制。2.缬沙坦能够抑制胶原蛋白表达和ROS激活,通过增加SSBP1表达拮抗AngⅡ诱导的MF。3.SSBP1是通过P53抑制AngⅡ诱导的MCFs增殖和胶原蛋白表达。4.SSBP1抑制MF与ROS途径无关。