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本文对一株从天然冬虫夏草子实体分离出的真菌Fungus G1进行了研究,通过对其形态学以及ITS序列进行分析,确定其为冬虫夏草的无性型菌株,属于弯颈霉属;在此基础上,对其胞内、胞外多糖组分进行了分离、纯化以及化学性质分析,研究了不同多糖组分对H22荷瘤小鼠的抗氧化及抗肿瘤作用,探讨了其抗肿瘤的作用机制。
首先,对分离自冬虫夏草的真菌Fungus G1进行鉴定,分析其与冬虫夏草间的关系;在对其进行传统形态学观察的基础上,提取其基因组DNA,通过PCR扩增其18S~28S rDNA之间的内转录间隔区(Internal Transcribed Sequence,ITS)及高度保守的5.8S rDNA序列,并进行测序,将所测得的序列用于系统发育分析。结果表明:Fungus G1的ITS序列与冬虫夏草的序列同源性可达99%;在系统发育树中,Fungus G1与冬虫夏草以及弯颈霉属的两种真菌聚为一个类群;因此,初步判定Fungus G1为冬虫夏草的无性型菌株,属于弯颈霉属。
液体培养真菌Fungus G1,将发酵液离心得上清液和菌丝体;上清液浓缩后经乙醇沉淀获得胞外粗多糖(EPS);菌丝体经蒸馏水清洗、烘干后磨碎,热水浸提并经乙醇沉淀得到胞内粗多糖(PS)。EPS、PS经离子交换柱层析盐梯度洗脱,分别得到水洗脱组分(EPSD1、PSD1)和盐洗脱组分(EPSD2、PSD2);用凝胶柱层析进一步纯化盐洗脱组分得到EPSD2G1、PSD2G1和PSD2G2。将纯化后的多糖通过Sephadex G-200进行纯度鉴定,结果显示EPSD2G1、PSD2G1和PSD2G2均呈单一对称峰。采用凝胶色谱法分别对EPSD2G1、PSD2G1和PSD2G2进行分子量测定,其分子量分别约为1.0×105、2.3×105和5.7×104。EPSD2G1、PSD2G1和PSD2G2的完全酸水解产物经乙酰衍生化后进行气相色谱(GC)分析,结果显示这三种多糖均由甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成,其比例分别约为23:1:2.6、3.3:2.3:1和8.1:1:4.1。
应用小鼠H22肝癌实验模型研究了多糖EPSD2及PS的抗肿瘤和抗氧化作用。结果显示,胞外多糖EPSD2对H22肿瘤的生长具有显著的抑制作用,并呈剂量效应,其中高剂量组的抑瘤率达82.18%;胞内多糖PS组对皮下H22肿瘤的生长亦有显著的抑制作用,其中低剂量组的抑瘤率可达61.70%。同时,特定剂量的胞内多糖可以显著提高荷瘤小鼠体内超氧化物岐化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力,降低脂质过氧化产物(MDA)的积累,并呈现明显的剂量效应;胞外多糖亦具有一定的抗氧化作用,但其抗氧化活力低于胞内多糖。综合国内外资料及本课题组前期的工作,推测在动物体内的抗氧化干预是虫草多糖抗肿瘤的作用机制之一。