论文部分内容阅读
目的：骨髓基质细胞(BMSCs)是一种骨髓来源的具有多向分化潜能的成体干细胞。它在一定条件下可以向多种结缔组织及部分来源于外胚层的组织分化，能形成骨、软骨、骨骼肌、神经细胞、脂肪细胞等。缺血性心脏病是一种严重危害人类健康的常见疾病，可导致心肌梗塞，最终诱发心力衰竭。现有的治疗方法只能部分改善心肌的缺血情况，防止进一步的心肌损害，并不能修复受损心肌，使已有心肌病变逆转，所以移植成肌细胞进入心肌组织形成新的心肌修复受损心肌受到广泛关注。随着细胞培养和分子生物学的发展，细胞移植治疗心肌梗死和心力衰竭成为可能。由于自体骨髓基质细胞无移植后免疫排斥反应，且细胞在体外有良好增殖能力，并能在适宜条件诱导下分化为损伤组织所需要的细胞，因而在心肌损伤的治疗中备受重视。研究表明5-氮胞苷(5-aza)可以作为体外的化学诱导剂使BMSCs向心肌细胞方向分化，但是有实验发现5-aza作为一种化学物质，在诱导分化的同时对细胞也具有一定毒性作用。同时心肌样微环境作为能使BMSCs向心肌细胞定向分化的另一因素越来越受到重视。有人提出体内微环境中有许多因素参与干细胞的分化，主要有化学因素和物理因素，前者是指细胞因子等，后者主要是指细胞与细胞间的相互作用，如缝隙连接、电刺激、收缩等。实验证明BMSCs无论异体移植、自体移植对心肌梗死后心功能的改善均有一定的作用。本实验采用BMSCs与心肌细胞体外共培养模拟心肌样微环境诱导BMSCs分化，应用免疫细胞化学、激光共聚焦显微镜观察、荧光显微镜观察等方法，探讨BMSCs诱导分化成心肌细胞与心肌样微环境的关系。
方法：
1.骨髓基质细胞的培养取出生2-3周的SD大鼠乳鼠，用水合氯醛麻醉、75％酒精消毒后，取股骨、胫骨骨髓，采用贴壁细胞分离法分离BMSCs，放入37℃、5％CO2培养箱中培养传代。
2.心肌细胞培养取出生1-5天的SD大鼠乳鼠，75％酒精消毒，开胸取心室肌剪成1mm3小块，用胰蛋白酶和胶原酶消化后，将细胞以105/ml接种于培养瓶中放入37℃、5％CO2培养箱中培养。
3.骨髓基质细胞与心肌细胞共培养将第三代的BMSCs从培养瓶消化解离，以103/ml的密度加入心肌细胞中，摇匀后进行共培养。取其中一部分BMSCs，于共培养前24小时先用DAPI标记2小时，用于进行免疫荧光检测。
4.免疫细胞化学检验骨髓基质细胞与心肌细胞共培养的第4天、第8天、第16天分别取出细胞爬片各为一组，单独培养的BMSCs作为对照组，用4％多聚甲醛固定后每组分别进行α-Actin、TnT抗体免疫细胞化学染色。
5.激光扫描共聚焦显微镜观察三组实验组和对照组细胞中首先加CD44作为第一个一抗，过夜，每组再分别加入α-Actin、TnT作为第二个一抗，用激光扫描共聚焦显微镜观察抗体表达。
6.荧光显微镜观察将用DAPI标记过的BMSCs与心肌细胞共培养，在共培养的第4天、第8天、第16天分别取出细胞爬片，各为一组，单独培养的BMSCs作为对照组，用4％多聚甲醛固定后，每组分别进行α-Actin、TnT抗体检测。用荧光显微镜观察实验结果。
结论：
1.免疫细胞化学染色共培养第4天、第8天、第16天三组细胞中α-Actin、TnT均有表达，对照组α-Actin与TnT均阴性表达，说明共培养可诱导BMSCs分化表达心肌特异性抗体。其中共培养第8天BMSCs阳性表达的细胞数量最多，α-Actin与TnT阳性表达率最强，至共培养第16天，α-Actin与TnT阳性表达率比共培养第8天有所下降。
2.激光扫描共聚焦显微镜观察CD44是BMSCs一种表面分子，细胞CD44表达阳性说明具有BMSCs的分子特性，可以与共培养中的心肌细胞区分开，两种抗体均为阳性说明BMSCs已经向心肌细胞分化。
3.荧光显微镜观察为排除BMSCs表达CD44可能出现的假阳性，用DAPI标记后，再用荧光显微镜观察，进一步说明了BMSCs可分化表达心肌特异性抗体。