论文部分内容阅读
研究背景目前，治疗严重心动过缓的主要措施是植入电子起搏器。但是这种治疗方法仍存在一些缺陷与不足，如电池寿命有限、心脏永久性植入导管、不受神经体液因素调节等。为了进一步提高患者的生活质量，希望构建一种“生物起搏器”，使其可以象正常窦房结细胞一样在人体内表达起搏电流并通过缝隙连接传导，弥补窦房结或房室结功能不足，改善病人生存状况。研究表明，超极化激活环核苷酸门控离子通道（HCN）表达的起搏电流在窦房结舒张期自动去极化过程中起着重要作用。HCN基因家族有4个成员，即HCN1～HCN4，其中HCN2对cAMP的反应强烈，有较快速的动力学等优点，是一种理想的生物起搏靶基因。干细胞具有自我增殖、多向分化潜能等优点，其研究及应用是国内外医学和生物学研究的热点之一。近年研究发现，成体干细胞不仅仅可以分化为组织特异性细胞，还具有跨系、跨胚层分化能力，同样可以分化为其他细胞或组织，为干细胞的应用开创了更为广泛的空间。此外，成体干细胞还具有易于取材，避免组织配型及免疫排斥反应，易于基因的导入及表达等优点。我们选用成体干细胞中的骨髓间充质干细胞作为传递基因的载体，利用转基因技术，将HCN2基因转入其中，构建“生物起搏器”，为将来替代电子起搏器用于临床治疗提供实验依据。目的本研究以mHCN2为生物起搏的靶基因，应用大鼠的骨髓间充质干细胞（MSCs）作为生物起搏的平台，通过载体质粒转染获得mHCN2基因修饰的MSCs，并检测mHCN2基因在核酸、蛋白及电流水平的表达，为生物起搏技术的应用奠定试验基础并为其可行性提供依据。方法采用密度梯度离心法和贴壁法相结合分离获得MSCs并用流式细胞术鉴定。EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切质粒pGH-mHCN2和pIRES2-EGFP，回收目的片断，T4DNA连接酶连接。转化筛选阳性菌落，酶切和测序鉴定mHCN2是否插入pIRES2-EGFP中。脂质体转染质粒pIRES2-EGFP-mHCN2至MSCs，24～48h后，荧光显微镜下通过观察EGFP表达情况进一步判断转染效率。通过RT-PCR技术及Western blot方法检测已导入基因mHCN2的MSCs中mHCN2 mRNA和蛋白的表达情况。利用膜片钳技术分别记录转染和未转染质粒mHCN2的MSCs的内向电流，并记录Cs+对电流的影响。结果流式细胞仪检测结果显示获得纯度为95％的MSCs。酶切鉴定和测序结果均证明mHCN2片断插入质粒pIRES2-EGFP。荧光显微镜下可见转染了质粒的MSCs发出绿色荧光。已转染质粒MSCs的mHCN2 mRNA是未转染质粒MSCs的5．31倍（P＜0．05），mHCN2蛋白是未转染的7．55倍（P＜0．05）。转染了mHCN2基因的细胞在超极化状态下记录到电压依赖型内向电流，未转染的MSCs未记录到该种电流。该电流在-140mV时被激活，阈电位为-60mV，半最大激活电位为（-95．1±0．9）mV。Cs+明显抑制该种电流。结论成功构建真核表达质粒pIRES2-EGFP-mHCN2并通过脂质体转染方法使其在MSCs中表达。外源性mHCN2基因在MSCs中核酸和蛋白水平上均有表达，并且也成功表达了具有生理性起搏电流特征的IHCN2。mHCN2基因修饰的MSCs有可能替代窦房结起搏细胞在自动除极过程中发挥重要作用。