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恶性肿瘤是造成人类死亡的第二号杀手,目前使用的化疗药物存在毒副作用大、耐药性强等诸多问题。因此从天然产物中寻找高效低毒的抗肿瘤药物已成为国内外研究的发展趋势。本论文以纳豆菌作为研究对象,围绕其抗肿瘤活性物质的分离纯化及其作用机制进行研究。
首先从纳豆菌代谢产物中,经过酸沉醇提、凝胶层析等手段分离纯化出具有明显抗肿瘤活性的单一组分脂肽(BnCLP),其分子量为1072Da。红外光谱分析表明该物质为环状脂肽,氨基酸自动分析仪和HPLC-MS/MS分析显示该环脂肽的氨基酸序列为Leu-Len-Val-Asp-Leu-Glu-Leu。
在此基础上首次对BnCLP的抗肿瘤活性进行了系统研究。噻唑蓝(MTT)实验结果显示BnCLP对人白血病K562细胞和乳腺癌MCF-7细胞均有较强的抑制作用,但在一定浓度范围内,对来自正常组织的人成纤维HLF细胞却无明显的毒副作用。荧光显微镜、透射电镜、原位缺口末端标记(TUNEL)以及乳酸脱氢酶(LDH)活力测定结果,证明BnCLP主要是通过凋亡途径抑制肿瘤细胞增殖。
本论文在证明BnCLP对肿瘤细胞杀伤作用具有选择性的基础上,探讨了BnCLP在K562细胞中诱导细胞凋亡的机制,目前尚未见相关报道。通过流式细胞仪考察BnCLP作用后细胞周期的变化,结果显示BnCLP通过影响K562细胞的细胞周期而诱导了细胞的凋亡,K562细胞被阻遏于细胞周期的G1期,且这种G1期积累具有显著的浓度和时间依赖性。激光共聚焦显微镜测定钙离子浓度,发现BnCLP诱导的K562细胞凋亡与[Ca2+]I相关,BnCLP作用后细胞内[Ca2+]I升高,并随着时间的延长[Ca2+]I也随之升高。通过Western-blot方法测定p21、p27、CylinD1、MAPK、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Cytochrome c等相关蛋白的变化,同时还利用Caspase-9、Caspase-3、ERK、JNK、p38抑制剂考察它们对BnCLP作用的影响。结果显示随着BnCLP浓度增大和作用时间的延长,p21、p27蛋白的表达率显著增加,呈明显的浓度依赖和时间依赖效应,而CylinD1则随着药物作用浓度增加和作用时间的延长表达量下调,表明p21、p27蛋白的上调表达及CylinD1的下调参与了BnCLP诱导K562细胞凋亡的过程,这一实验结果与流式细胞检测结果相吻合。采用Western-blot考察MAPK是否参与了BnCLP诱导的凋亡过程,结果表明BnC:P并未改变JNK和p38蛋白表达,对磷酸化的JNK和p38表达也无明显影响,但却上调了ERK蛋白表达,对磷酸化的ERK表达也有一定的促进作用。为进一步验证p38、JNK和ERK是否参与BnCLP诱导的K562细胞凋亡过程,测定了JNK、p38和ERK抑制剂对BnCLP引起的K562细胞凋亡的影响。结果表明ERK抑制剂可明显抑制BnCLP诱导的细胞凋亡,而JNK、p38抑制剂对BnCLP诱导的细胞凋亡无显著影响,这也进一步验证了ERK参与了BnCLP诱导的K562细胞凋亡过程。为揭示[Ca2+]I与ERK之间的关系,使用钙离子抑制剂与BnCLP共同作用于K562细胞。结果表明钙离子抑制剂能下调ERK蛋白的表达,对磷酸化的ERK表达也有一定的削弱作用,并抑制BnCLP诱导的细胞凋亡。在BnCLP诱导K562细胞的凋亡途径中,Caspase-3和9被激活,Caspase-3,9抑制剂均可显著抑制BnCLP引起的凋亡。应用Westen-blot法发现BnCLP可明显上调促凋亡蛋白Bax的表达,而且同时下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,表明BnCLP诱导的凋亡是由Caspase家族和Bcl-2家族共同调控的。而Bax过表达可改变线粒体膜通透性,释放Cytochrome c,从而激活Caspase-9,再继续激活下游的Caspase-3,形成一个正反馈调节,从而扩大Caspase级联反应。由此推测BnCLP的抗肿瘤作用机制为:纳豆菌环脂肽作用K562细胞后,首先诱发[Ca2+]I浓度增加,继而激活ERK及磷酸化ERK的上调,Caspase家族及Bcl-2家族共同调控纳豆菌环脂肽诱导的K562细胞凋亡,Caspase-3处于线粒体中的Bcl-2及Bax上游,Caspase-9则处于Bcl-2和Bax下游,而Bax的过表达可使Cytochrome c从线粒体释放,与Apf-1及Caspase-9形成复合物,活化的Caspase-9进一步激活Caspase-3,这样就完成了一个正反馈调控环。
在体外实验的基础上,选用造模剂二甲基苯葸(DMBA)和甲基亚硝基脲(MNU)诱导大鼠乳腺癌,作为BnCLP体内实验的乳腺癌动物模型。通过给药组和对照组的比较,测定BnCLP的体内抗肿瘤作用与毒副作用。结果显示在抑瘤率与顺铂(DDP)相差不大的情况下,BnCLP对肝脏、肾脏的毒性明显低于顺铂,平均体重和生存率也有一定程度的提高。通过对给药组和对照组乳腺癌动物模型乳腺组织相关基因PCNA、ER和p53表达水平的测定,发现大鼠经BnCLP处理后,ER和p53基因表达水平均有一定程度的提高;PCNA基因表达水平受到了抑制。
本论文从纳豆菌代谢产物中分离纯化到体外具有明显抗肿瘤活性的环脂肽(BnCLP),其分子量为1072Da,并对该组分的结构进行了解析。进一步抗肿瘤作用机制研究和体内实验,揭示了BnCLP是通过诱导凋亡抑制肿瘤细胞增殖,并对BnCLP诱导细胞凋亡的信号通路进行了探讨;体内实验显示BnCLP具有明显的抑瘤活性。该研究为纳豆菌代谢产物的应用奠定了坚实的理论基础。