论文部分内容阅读
目的：探讨低氧处理BMSCs获得的exosome抗细胞凋亡作用机制方法：准备无exosome的血清，利用超速离心法（120000g7h）去除掉血清中的exosome保证实验用的血清无exosome的干扰。比较超速离心、ExoQuick-TC试剂盒和改良试剂盒三种方法提取的exosome，建立exosome有效提取方法。exosome抗细胞凋亡实验分三组：①对照组（Control）加入PBS液；②正常组（Normal）：加入正常培养BMSCs上清液中的exosome；③低氧组（Hypoxia）加入低氧培养BMSCs上清液中的exosome；将上述培养成分加入BMSCs中，放在含5%氧气的低氧培养箱中培养三天，分别用流式细胞仪测定三组BMSCs的凋亡率。将细胞凋亡信号通路图中的119个基因在exosome数据库中(包含2127中RNA)经过筛选得到5个重要基因。对筛选出的基因进行引物设计，接着分别提取低氧和正常培养来源的exosomes中的RNA并立即反转录为cDNA，使用荧光定量PCR检测两种exosomes中所筛选基因的相对表达量差别，试图从基因层面探讨exosome抗细胞凋亡的机制。结果：①超速离心法获得的exosome浓度是55.29ug/ml，试剂盒提取的exosome浓度是393ug/ml，改良法提取的exosome浓度是2028ug/ml，改良法提取的exosome浓度明显高于其它两种方法。②对照组中骨髓间充质干细胞的凋亡率是93.3%，正常组中骨髓间充质干细胞的凋亡率是61%，低氧组中骨髓间充质干细胞是31.2%，低氧处理骨髓间充质干细胞来源exosome细胞凋亡率明显低于正常组和对照组；③结合细胞凋亡信号通路图从exosome数据库中筛选出5个重要基因：loc298795(14-3-3-sigma)、TSC2、caspase-6、FASL、Calpain；④荧光定量PCR测定低氧组exosome所包含的基因loc298795(14-3-3-sigma)表达量较其它组高，而TSC2和caspase-6表达量较其它组低（P<0.05）。结论：①BMSCs条件培养液中的exosome具有抗细胞凋亡作用。②低氧培养大鼠BMSCs来源的exosome抗细胞凋亡能力明显优于正常组和对照组。③LOC298795、Tsc2和caspase-6基因在exosome抗细胞凋亡中发挥了重要作用。