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本文以模式植物烟草为对象,研究了猪伪狂犬病病毒(PseudorabiesVirus,PRV)糖蛋白gD基因在转基因植物中的表达。并在此基础上,以PRV糖蛋白gD基因和玉米胚乳特异表达启动子(Globulin-1)构建的重组质粒pGLB-gD为载体,应用农杆菌介导法转化超甜玉米幼胚,成功获得了转基因植株;同时研究了根癌农杆菌浓度、共培养时间与温度对玉米转化率的影响。主要研究结果如下:
1.利用叶圆片法,通过根癌农杆菌介导将PRV糖蛋白gD基因导入烟草叶肉细胞,经愈伤组织诱导、筛选、继代及再生,成功获得了再生植株。通过PCR分子标记、PCR-Southern分子杂交确认gD基因已整合进烟草再生植株细胞的基因组中,经Western-blotting杂交证明外源的PRV糖蛋白gD基因能在转基因烟草中正确表达。
2.在26~28℃条件下,分别以0.3、0.6、1.0的菌液浓度(OD600值)浸染玉米幼胚5min,然后在22℃下进行共培养、恢复性培养和抗性愈伤组织筛选等过程,发现原菌液浓度在OD600值为0.5,感染浓度在0.3时,转化效率最高,抗性愈伤组织的形成率为23.7%。
3.在原菌液浓度和感染浓度分别为OD600值0.5和0.3时,以22℃、25℃和28℃3个温度分别进行1d、2d和3d时间的共培养,分别统计幼胚抗性愈伤组织的形成率,结果显示,在22℃共培养3d的条件下转化效率最高,抗性愈伤组织的幼胚的形成率为24.6%。
4.由根癌农杆菌转化玉米幼胚获得的转基因玉米植株,经分子鉴定、点杂交、Southern印迹杂交,确认PRV糖蛋白gD基因成功整合进玉米植株细胞的基因组中。