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[目的]
PICET32是本实验室构建的一种新型表达载体,预测其可能具有体外高效表达并且获得活性好的重组蛋白的特性。本实验将前期得到的犬钩虫抗凝肽AcaNAP7插入该新型表达载体中,对重组目的产物蛋白的表达规律进行了优化研究,分析重组AcaNAP7的表达情况并研究其活性,为新型表达载体PICET32应用于重组生产钩虫抗凝肽奠定基础。
[方法]
1.重组犬钩虫抗凝肽PICET32/AcaNAP7的构建
设计引物,扩增AcaNAP7成熟肽编码基因,克隆入原核表达载体PICET32中,得到重组原核表达质粒PICET32/AcaNAP7。同时,利用前期构建成功的另一载体PETH作为对照,构建重组原核表达质粒PETH/AcaNAP7。
2.犬钩虫抗凝肽的AcaNAP7原核表达和纯化
将构建好的重组表达质粒PICET32/AcaNAP7和PETH/AcaNAP7,转化大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE分析表达情况。通过缓冲液pH值和取样时间点的改变,摸索PICET32/AcaNAP7最佳自剪切条件。
PICET32/AcaNAP7重组表达产物经Ni-IDA亲和层析和快速几丁质柱纯化,PETH/AcaNAP7重组表达产物经Ni-IDA亲和层析纯化后获得目的蛋白。
3.目的蛋白AcaNAP7抗凝活性检测
纯化得到的目的蛋白用凝血酶原时间(PT)检测其体外抗凝活性。
[结果]
1.重组犬钩虫抗凝肽PICET32/AcaNAP7和PETH/AcaNAP7的构建
经PCR、双酶切和测序鉴定,结果均表明PICET32/AcaNAP7和PETH/AcaNAP7重组表达质粒构建成功。
2.犬钩虫抗凝肽的AcaNAP7原核表达和纯化
用IPTG能诱导重组蛋白PICET32/AcaNAP7和PETH/AcaNAP7在大肠杆菌中高效表达,表达产物主要以可溶形式存在,每升培养基中目的蛋白的产量分别为79.72mg和33.14mg。其中PICET32/AcaNAP7蛋白上清,通过自剪切率的比较来看,pH6.436h后取样的样品自剪切效果最佳。纯化得到的重组蛋白纯度高达95％。
3.目的蛋白AcaNAP7抗凝活性检测
PICET32/AcaNAP7和PETH/AcaNAP7两种重组蛋白3批纯化产物100nM的PT值经SPSS13.0分析,两种重组蛋白之间差异具有统计学意义(P＜0.05)。上述两种重组蛋白延长两倍正常PT所需的蛋白浓度分别为24.8nM和31.5nM。
[结论]
用PICET32和PETH两种载体制备的重组蛋白AcaNAP7在大肠杆菌中可得到高效的可溶性表达,其中PICET32载体表达的目的蛋白的产量明显高于PETH表达的目的蛋白,可能由于Trx能促进蛋白可溶性表达。PICET32/AcaNAP7蛋白上清于pH6.436h后取样的样品自剪切效果最佳。上述两种重组蛋白PT活性差异具有统计学意义。其中PICET32/AcaNAP7活性明显优于PETH/AcaNAP7,可能由于Trx能促进含有二硫键蛋白的正确折叠,从而保证重组蛋白生物活性。本实验表明,PICET32载体能在体外高效表达的同时,并能产生并经济地获得活性好的含多对二硫键的钩虫抗凝肽,为钩虫抗凝肽的大规模生产,经济高效分离工艺提供了前期依据,同时为新型表达载体PICET32的开发应用奠定了基础。