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目的研究circRNA在人激素性股骨头坏死标本中的表达情况,明确差异表达circRNA的表达谱,并验证差异表达的circRNA,筛选出目标分子;研究circUSP45对细胞功能如细胞增殖、细胞凋亡和成骨分化的调控作用,从细胞和分子生物学水平验证circUSP45调控细胞功能的机制;深入研究circUSP45/miR-127-5p/PTEN/AKT信号轴在激素性股骨头坏死中的调控机制,并通过大鼠激素性股骨头坏死模型进行验证。方法第一部分:收集临床激素性股骨头坏死的股骨头和股骨颈骨折股骨头样本,通过倾向值匹配的方法进一步筛选出个体差异较小的样本,并通过circRNA二代测序和生信分析筛选出差异表达的circRNA并构建circRNA表达谱,最后通过q-PCR验证差异表达的circRNA,并选定最终深入研究的circRNA。第二部分:在细胞水平使用地塞米松处理细胞,通过q-PCR验证circUSP45在细胞水平和临床样本是否一致;通过CCK-8、EdU染色验证circUSP45对细胞增殖能力的影响;通过TUNEL染色、western blotting和Annexin V FITC-PI凋亡双染验证circUSP45对细胞凋亡的影响;通过成骨诱导、western blotting检测成骨指标和茜素红染色明确circUSP45对成骨分化能力的影响;使用RNA FISH明确circUSP45的细胞定位;通过生信分析预测结合位点、q-PCR、RNA-pull down实验、荧光素酶报告实验和RNA FISH明确circUSP45与miR-127-5p存在直接作用靶点;通过生信分析预测结合位点、q-PCR、荧光素酶报告实验和western blotting明确miR-127-5p和PTEN的作用关系,并通过western blotting检测是否对下游的AKT信号通路存在影响。第三部分:构建大鼠激素性股骨头坏死动物模型,并在大鼠体内敲低circUSP45的表达验证circUSP45对大鼠激素性股骨头坏死的调控作用;通过HE染色、masson染色和microCT检测评价大鼠股骨头骨小梁的结构变化;通过免疫组化染色、western blotting和q-PCR验证大鼠股骨头成骨指标的变化和AKT信号通路在激素性股骨头坏死中的作用。结果第一部分:(1)倾向值匹配结果显示:实验组与对照组的年龄(P=0.437)、性别(P=0.1165)、BMI(P=0.8747)的差异均无统计学意义。(2)从筛选出的样本中挑选三对进行circRNA二代测序,RNA测序结果显示样本1测得的circRNA有2503个,样本2测得的circRNA有3220个,样本3测得的circRNA有2497个,样本4测得的circRNA有3137个,样本5测得的circRNA有2081个,样本6测得的circRNA有1204个。我们将差异表达倍数为2,P<0.05定义为差异有统计学意义,与正常对照组相比SONFH组表达上调的circRNA有58个,表达下调的circRNA有21个。(3)激素性股骨头坏死组circUSP45的表达量比对照组高5.42倍;我们通过RNA酶耐受实验发现RNA酶可以有效降低USP45 mRNA的表达,但是circUSP45可以有效耐受RNA酶(P<0.05)。(4)Western blotting结果显示,与Fracture组相比SONFH组的成骨指标BMP2、OPG表达显著受到抑制,而破骨指标RANKL表达显著提高(P<0.05)。第二部分:(1)与正常对照组相比,使用10μM的地塞米松处理骨髓间充质干细胞24h可以有效促进circUSP45的表达,地塞米松处理组circUSP45的表达量较正常对照组高3.1倍(P<0.05);敲低circUSP45的表达可以显著促进细胞的增殖;在骨髓间充质干细胞中过表达circUSP45显著抑制Runx2和BMP2的表达,与正常对照组和地塞米松组相比差异有统计学意义(P<0.05);过表达circUSP45同样可以显著抑制骨髓间充质干细胞成骨分化。(2)TUNEL结果显示,过表达circUSP45组TUNEL阳性细胞与正常对照组相比也显著增加(P<0.05);Dex+敲减circUSP45组TUNEL阳性细胞较正常组差异无统计学意义;Annexin V FITC-PI结果显示:在正常对照组处于早期凋亡的细胞占14.76%,晚期凋亡的细胞占0.16%,死亡的细胞占0.02%;地塞米松处理组处于早期凋亡的细胞占58.27%,处于晚期凋亡的细胞占1.25%,死亡的细胞占0.05%;Dex+si-circUSP45处理组中凋亡早期的细胞占15.48%,凋亡晚期的细胞占0.13%,死亡的细胞占0.05%;过表达circUSP45的处理组早期凋亡的细胞占30.98%,晚期凋亡的细胞占0.3%,死亡的细胞占0.03%;我们通过western blotting检测凋亡相关蛋白的表达来进一步确定circUSP45对细胞凋亡的影响,Dex+si-circUSP45可以显著抑制cleaved-caspase-3的表达,Dex+si-circUSP45可以显著促进Bcl-2的表达,Dex+si-circUSP45可以显著抑制Bax蛋白的表达。(3)RNA FISH显示circUSP45的荧光主要定位于细胞质;q-PCR显示过表达circUSP45时miR-127-5p的表达量降低,敲减circUSP45时miR-127-5p的表达量升高;荧光素酶报告实验显示转染pGL3-circUSP45和miR-127 mimics组荧光强度显著降低;通过RNA-pull down实验发现生物素标记的miR-127-5p组的circUSP45表达量显著增高;RNA FISH显示circUSP45与miR-127-5p均定位于细胞质。(4)LV-circUSP45+miR-127-5p mimics组成骨能力显著得到改善但仍然比scramble组和miR-127-5p mimics组差,miR-127-5p mimics组的成骨能力是最强;CCK-8结果显示过表达circUSP45显著抑制细胞的增殖能力,过表达circUSP45的基础上转染miR-127-5p mimics可以有效的促进细胞增殖,EdU染色结果显示scramble组处于增殖期的细胞为31.01%,LV-circUSP45组处于增殖期的细胞为14.99%;LV-circUSP45+miR-127-5p mimics组处于增殖期的细胞为28.67%;miR-127-5p mimics组处于增殖期的细胞为40.23%,与CCK-8结果基本一致;LV-circUSP45组的细胞显著发生凋亡,但是在过表达circUSP45的基础上转染miR-127-5p mimics可以有效的抑制细胞凋亡。(5)转染miR-127-5p mimics可以显著降低PTEN组的荧光强度(P<0.05);转染miR-127-5p inhibitor可以显著提高PTEN组的荧光强度(P<0.05);地塞米松显著降低miR-127-5p的表达(P<0.05);Dex+bpV(phen)组的miR-127-5p的表达显著提高;Dex可以显著抑制p-AKT的表达,Dex+miR-127-5p mimics可以显著的促进AKT和p-AKT的表达;Dex显著抑制细胞的增殖能力(P<0.05);Dex+miR-127-5p mimics可以显著的促进细胞增殖(P<0.05),Dex+bpV(phen)可以显著的促进细胞增殖(P<0.05);Dex组显著抑制成骨;Dex+miR-127-5p mimics组或Dex+bpV(phen)组可以显著的促进成骨。第三部分:(1)正常对照组股骨头内的骨小梁排列规则且完整无破坏,仅有少量的空泡状组织;SONFH组可以显著观察到股骨头坏死,其骨小梁结构显著遭到破坏,坏死股骨头小梁结构大部分被纤维组织替代,空泡状的坏死组织显著增多;SONFH+si-circRNA组股骨头内的骨小梁排列规则且完整无破坏,仅有少量的空泡状组织;SONFH+scramble组的骨小梁结构显著遭到破坏,坏死股骨头小梁结构大部分被纤维组织替代,空泡状的坏死组织显著增多。(2)正常对照组骨小梁清晰且排列紧密,成熟的骨组织较多,新生骨较少;SONFH组骨小梁结构基本消失,空泡状组织显著增多,仅有少量新生骨着色;SONFH+si-circRNA组的骨小梁清晰且排列良好,仅有少量的空泡状组织,成熟骨较少,有大量新生骨生成,说明骨代谢处于活跃状态;SONFH+scramble组的骨小梁结构基本消失,被空泡状的纤维组织代替,成熟骨组织基本消失,仅有少量新生骨着色。(3)正常对照组股骨头的p-AKT显著高表达;SONFH组和SONFH+scramble组中股骨头p-AKT的表达量显著降低;在SONFH中抑制circUSP45的表达可以显著促进AKT的表达。(4)SONFH组和SONFH+scramble组的Runx2和BMP2的表达量显著降低(P<0.05);而SONFH+si-circRNA组的表达量显著增加(P<0.05)。(5)SONFH组和SONFH+scramble组的caspase-3和cleaved-caspase-3的表达量较正常对照组显著升高(P<0.05);而SONFH+si-circRNA组caspase-3和cleaved-caspase-3的表达量显著降低(P<0.05);SONFH组和SONFH+scramble组的AKT和p-AKT的表达量较正常对照组显著降低(P<0.05);而SONFH+si-circRNA组的总AKT和p-AKT的表达量显著增高(P<0.05)。(6)与正常对照组相比,SONFH组的BV/TV、Tb.Th、Tb.N显著降低,Tb.Sp显著高于正常对照组(P<0.05);与SONFH+scramble组相比,SONFH+si-circRNA组的BV/TV、Tb.Th、Tb.N显著升高,Tb.Sp显著低于SONFH+scramble组(P<0.05)。结论(1)circUSP45在人激素性股骨头坏死标本中显著高表达,circUSP45通过抑制骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化、促进髓间充质干细胞凋亡调控激素性股骨头坏死。(2)circUSP45在细胞中的表达水平与人SONFH标本中的表达水平一致;且circUSP45调控细胞增殖、凋亡和成骨分化是通过吸附miR-127-5p进行调控的。(3)miR-127-5p通过PTEN/AKT信号通路调细胞增殖、细胞凋亡和成骨分化;circUSP45通过miR-127-5p/PTEN/AKT信号级联调控激素性股骨头坏死。